目的用大腸埃希菌表達布魯氏菌S2株L7/L12蛋白,制備其多克隆抗體。方法設計引物,以S2弱毒株DNA基因組為模板擴增目的基因片段L7/L12,構(gòu)建pET28a-L7/L12質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21（DE3）,IPTG誘導目的蛋白表達,SDS-PAGE檢測表達蛋白的可溶性及其分子質(zhì)量;金屬親和層析法純化目的蛋白,BCA法對純化蛋白定量。將rL7/L12蛋白與弗氏完全佐劑混合（終濃度為0.5mg/ml）,每次1ml分兩次間隔21d免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體。免疫結(jié)束后12d,頸靜脈采血,分離血清,采用間接ELISA法檢測血清抗體效價。以免疫血清1∶200倍稀釋作為一抗,采用Western blot分析其與r-L7/L12、布魯氏菌S2株全菌體蛋白及大腸埃希菌DH5α全菌體蛋白結(jié)合的特異性。結(jié)果經(jīng)測序與酶切鑒定,成功構(gòu)建表達載體pET28a-L7/L12,SDS-PAGA分析表達產(chǎn)物部分為可溶性,分子質(zhì)量單位約為14ku;SDS-PAGE分析親和純化蛋白為單一條帶,蛋白質(zhì)含量為0.8mg/ml。間接ELISA檢測免疫血清抗體效價為1∶12 800,該抗體能夠與r-L7/L1... 

【文章來源】：中國病原生物學雜志. 2014,9(12)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖１Ｌ７／Ｌ１２基因ＰＣＲ產(chǎn)物０．８％瓊脂糖凝膠電泳圖ＭＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ１Ｌ７／Ｌ１２ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＦｉｇ．１Ｌ７／Ｌ１２ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＰＣＲ

２Ｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ３Ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ４ＵｎｉｎｔｒｕｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａＭｐｒｏ－ｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ５ＰｕｒｉｆｉｅｄＬ７／Ｌ１２Ｆｉｇ．３ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓＬ７／Ｌ１２ｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖４ｒ－Ｌ７／Ｌ１２蛋白免疫兔多克隆抗體效價Ｆｉｇ．４ｒＬ７／Ｌ１２ａｓｃｏａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｉｔｅｒ（ｘ±ｓ）·１０６９·中國病原生物學雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１４年１２月第９卷第１２期Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１４，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１２

Ｍ蛋白分子質(zhì)量標準１ｒＬ７／Ｌ１２蛋白與多克隆抗體反應條帶２布魯氏菌Ｓ２菌體裂解蛋白對照３大腸埃希菌菌體蛋白對照圖５抗Ｌ７／Ｌ１２多克隆抗體Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ１ｒＬ７／Ｌ１２２ＢｒｕｃｅｌｌａＳ２ｇｒｏｓｓｐｒｏｔｅｉｎｓ３Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）Ｆｉｇ．５Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ討論每年全世界報告布魯氏菌感染人間病例約５０００００例，受感染范圍波及南美洲、亞洲、非洲及地中海地區(qū)，給人類造成巨大的損失，而接種疫苗可預防布魯氏菌病的爆發(fā)流行［６］。當前布魯氏菌的研究主要方向包括布魯氏菌重要免疫抗原的研究［６］，與其致病相關聯(lián)的Ⅳ型分泌系統(tǒng)研究［７］，在人體引起固有免疫應答的信號傳導機制的研究［８］及其在人體適應性免疫應答過程中的逃逸機制研究［９］等。其中布魯氏菌重要免疫抗原的研究一直是熱點問題。Ｌ７／Ｌ１２是布魯氏菌重要免疫抗原之一，屬核糖體蛋白中的一員，參與布魯氏菌蛋白質(zhì)合成過程，結(jié)構(gòu)保守，是良好的疫苗候選抗原蛋白［１０］。Ｔａｂｙｎｏｖ等［１１－１２］將Ｌ７／Ｌ１２蛋白與流感病毒載體結(jié)合包裹成類病毒顆粒作為疫苗抗原，免疫小鼠和豚鼠后發(fā)現(xiàn)該抗原可以作為疫苗預防Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ５４４株所引起的感染。Ｌｕｏ等［１３］報道Ｌ７／Ｌ１２作為布魯氏菌疫苗抗原的機制之一是天然的Ｌ７／Ｌ１２蛋白內(nèi)含Ｔ細胞表位，能夠刺激機體產(chǎn)生Ｔｈ１類細胞免疫應答，通過分泌的ＩＦＮ－γ刺激巨噬

【參考文獻】：
期刊論文
[1]我國布魯氏菌感染的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 成巖,白靚,張樹軍.  內(nèi)蒙古民族大學學報(自然科學版). 2012(03)



本文編號：3291358