目的分析感染廣州管圓線蟲后福壽螺G型溶菌酶基因的組織表達特征。方法根據(jù)福壽螺G型溶菌酶基因序列,設(shè)計特異性引物, PCR擴增后進行測序,利用在線軟件ExPASy、 signalP 4.1、 TMHMM2.0、Smart、 MEGA7對其序列的基本生物學(xué)信息進行分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。取含有廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的大鼠糞便喂食福壽螺,感染后24 h統(tǒng)一飼養(yǎng),分別于感染后1、 10、 20、 30 d各取3～5只福壽螺采集肝胰腺、腎臟、腸道、頭足和鰓組織,未感染的福壽螺為陰性對照組。提取各個感染時期福壽螺各組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR分析福壽螺G型溶菌酶mRNA的組織表達特征,設(shè)定對照組福壽螺各組織的G型溶菌酶m RNA的相對表達量為1.0±0.0。結(jié)果PCR擴增福壽螺G型溶菌酶基因片段,長度約為800 bp。測序結(jié)果顯示,為一段828 bp的完整開放讀碼框,編碼275個氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示, G型溶菌酶基因編碼產(chǎn)物為穩(wěn)定的疏水性蛋白,在1～19位存在1個信號肽,主要在細胞外包括細胞壁發(fā)揮作用,在18～85位氨基酸處存在1個SH3b結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析顯示,福壽... 

【文章來源】：中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2019,37(03)北大核心CSCD

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福壽螺G型溶菌酶的氨基酸序列與其他物種序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.2PhylogenetictreeanalysisofP.canaliculateGtypelysozymesequencewithitshomologuesindifferentsnailsandfishes0.1096小管福壽螺Pomaceacanaliculata尖膀胱螺Physellaacuta(ADV36303.1)

中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志2019年6月第37卷第3期ChinJParasitolParasitDisJune2019，Vol.37，No.3圖2福壽螺G型溶菌酶的氨基酸序列與其他物種序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.2PhylogenetictreeanalysisofP.canaliculateGtypelysozymesequencewithitshomologuesindifferentsnailsandfishes0.1096100小管福壽螺Pomaceacanaliculata尖膀胱螺Physellaacuta(ADV36303.1)蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis(AEY77130.1)櫛孔扇貝Azumapectenfarreri(ABB53641.1)膨腹海馬Hippocampusabdominalis(ART85744.1)塞內(nèi)加爾鰨Soleaseneqalensis(CCB84597.1)半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis(NP001281118.1)卵形鯧鯵Trachinotusovatus(ANS12746.1)腔棘魚Latimeriamenadoensis(AHG59337.1)黃顙魚Tachysurusfulvidraco(ALD84262.1)草魚Ctenopharyngodonidella(ACF41165.1)鯽魚Carassiusauratus(AJY58045.1)97977934976996M：DNA標志物；1、2：福壽螺M:DNAmarker；1,2：P.canaliculata圖1福壽螺G型溶菌酶基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果Fig.1AgarosegelelectrophoresisanalysisofamplifiedGtypelysozymecDNAfromP.canaliculataM12bp1200900700500300100的完整開放讀碼框，編碼275個氨基酸。利用在線軟件預(yù)測其相對分子質(zhì)量（Mr）為28910，等電點（PI）值為6.47，脂肪系數(shù)為73.85；合成目的蛋白的氨基酸共有20種，其中帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）共有17個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）共有13個；不穩(wěn)定系數(shù)為37.07，小于40，為穩(wěn)定蛋白，親水指數(shù)總平均為-0.12，說明該蛋白是疏水性蛋白。

中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志2019年6月第37卷第3期ChinJParasitolParasitDisJune2019，Vol.37，No.310、20d低于對照組的（P＜0.05），30d與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；感染后1、10、20、30d腸道組織中表達量分別為0.280±0.040、0.070±0.030、0.039±0.002、0.120±0.050，各時期相對表達量均低于對照組（P＜0.05）；感染后1、10、20、30d頭足部組織中表達量分別為0.280±0.150、0.150±0.008、0.031±0.011、0.120±0.030，各時期相對表達量均低于對照組（P＜0.05）（圖4）。3討論溶菌酶是一類具有殺菌免疫作用的功能分子，對于缺少特異性免疫的無脊椎動物來說，溶菌酶在機體的免疫體系中是非常重要的一個環(huán)節(jié)［11-12］。本研究基于本課題組對福壽螺感染廣州管圓線蟲后的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出福壽螺G型溶菌酶基因序列，經(jīng)擴增測序得到一段828bp的完整開放讀碼框，含有275個氨基酸。預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量較高，α-螺旋是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中最常見、最典型、含量也較為豐富的二級結(jié)構(gòu)元件，而無規(guī)則卷曲是構(gòu)成酶重要活性部位和蛋白質(zhì)特異功能部位的二級結(jié)構(gòu)元件［13］。福壽螺G型溶菌酶蛋白在1～19位存在一個信號肽，屬于分泌蛋白，結(jié)合亞細胞定位分析顯示，G型溶菌酶主要在細胞外包括細胞壁發(fā)揮作用，這也與G型溶菌酶的抗菌作用機制相符合。SH3b結(jié)構(gòu)域能夠識別富含脯氨酸和疏水殘基的蛋白質(zhì)并與之結(jié)合，介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，說明福壽螺的G型溶菌酶還參與了機體多種細胞內(nèi)的生化反應(yīng)，包括細胞增殖、運動等。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3247890