目的腸膠質(zhì)細(xì)胞（enteric glial cell,EGC）在腸道多種生理及病理過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,為了深入研究EGC的功能,排除在體及組織水平中神經(jīng)體液因素的影響,獲得一種簡便高效的原代EGC分離培養(yǎng)方法非常必要。方法取小鼠結(jié)腸縱行肌-肌間神經(jīng)叢組織,經(jīng)消化分離腸膠質(zhì)細(xì)胞,采用含血清和無血清培養(yǎng)基交替培養(yǎng)法去除成纖維細(xì)胞后常規(guī)傳代;運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測原代EGC純度;運(yùn)用胞內(nèi)鈣成像技術(shù)實(shí)時觀察EGC內(nèi)Ca2+濃度（[Ca2+]i）變化以檢測細(xì)胞活性。結(jié)果每次實(shí)驗(yàn)獲得的EGC至傳代前細(xì)胞量可達(dá)約6. 8×105;無血清培養(yǎng)后成纖維細(xì)胞污染顯著降低;膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）陽性的EGC占細(xì)胞總數(shù)的98. 44%±1. 07%,鈣結(jié)合蛋白S100β陽性EGC占93. 61%±3. 16%,GFAP與S100β雙陽性EGC占93. 09%±2. 99%; 96. 00%±4. 00%的細(xì)胞在ATP誘導(dǎo)下發(fā)生胞內(nèi)鈣瞬變。結(jié)論結(jié)合無血清培養(yǎng)可有效去除成纖維細(xì)胞污染,得到純度較高、活性較好的肌間神經(jīng)叢EGC。 

【文章來源】：首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,40(02)北大核心

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EGC在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布

首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)第40卷1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用GraphPadPrism6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。2結(jié)果2.1EGC在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是目前較常用的成熟EGC標(biāo)志物，小鼠結(jié)腸組織水平免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示，GFAP陽性的EGC在肌間神經(jīng)叢大量分布，并與神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)原纖維(neurofilament，NF)不共存，表明GFAP可作為結(jié)腸EGC的標(biāo)志物，詳見圖1。2.2原代EGC純度運(yùn)用EGC標(biāo)志物GFAP免疫熒光標(biāo)記EGC，觀察其在原代細(xì)胞中的比例，結(jié)果顯示運(yùn)用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代細(xì)胞中，只有部分細(xì)胞表現(xiàn)出GFAP陽性，以平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin，α-SMA)與GFAP雙標(biāo)記染色可見，GFAP陰性的細(xì)胞多表現(xiàn)為α-SMA陽性，且胞核呈卵圓形，符合成纖維細(xì)胞的特征(圖2A)，表明含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代細(xì)胞中存在大量的成纖維細(xì)胞污染。運(yùn)用無血清培養(yǎng)后，可見原代細(xì)胞中絕大多數(shù)細(xì)胞均呈現(xiàn)GFAP陽性圖1EGC在結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布Fig.1DistributionofEGCincolonicmyentericplexusA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandNFinmyentericplexusofcolon;NF:neurofilament;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;EGC:entericglialcell．圖2原代EGC細(xì)胞純度Fig.2PurityofprimaryEGCA:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandα-SMAinserum-containingculturedEGC;B:double-labelimmunofluorescenceofGFAPandS100－βinserum-freeculturedEGC;EGC:entericglialcell;GFAP:glialfibrillaryacidicprotein;α-SMA:α-smoothmuscleactin．432

誚郵蹵TP刺激后可表現(xiàn)出顯著的胞內(nèi)鈣瞬變，而成纖維細(xì)胞則不具備這種特性。以Ca2+熒光探針fluo-4AM孵育細(xì)胞，給予10μmol/LATP，利用熒光顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)檢測探針熒光強(qiáng)度，動態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的變化。如圖3所示，靜息狀態(tài)下胞內(nèi)［Ca2+］i維持在較平穩(wěn)的水平，ATP給藥后，96.00%±4.00%，95%CI為(84.89，107.1)的細(xì)胞發(fā)生胞內(nèi)鈣瞬變，結(jié)果來自3批細(xì)胞共6次實(shí)驗(yàn)，主要表現(xiàn)為胞內(nèi)［Ca2+］i在短時間內(nèi)快速升高(Fm/F0=1.93±0.08)隨后又迅速恢復(fù)至基線水平的周期性變化，提示原代EGC反應(yīng)性良好。圖3ATP引起原代EGC胞內(nèi)鈣瞬變Fig.3ATPinducedCa2+transientsinprimaryEGCA:representativeimagesofprimaryEGCloadedwithFluo-4atrest(left)anduponactivation(right)withATP(10μmol/L);scalebar:70μm;B:representativetracesofATP-inducedCa2+transientsforthreeindividualcells;EGC:entericglialcell．3討論肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)過程中，成纖維細(xì)胞在操作中難以去除，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中分裂增生十分迅速，因此成為制約EGC原代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)室利用成纖維細(xì)胞對血清依賴生長的特性，在現(xiàn)有肌間神經(jīng)叢EGC原代培養(yǎng)方法［9］中結(jié)合無血清法，較特異地去除了成纖維細(xì)胞污染。本實(shí)驗(yàn)前期，本課題組參考了Smith等［9］建立的小鼠原代EGC分離方法，成功分離了小鼠結(jié)腸EGC，但在細(xì)胞鑒定中觀察到大量GFAP陰性而α-SMA陽性的細(xì)胞，提示原代細(xì)胞中存在成纖維細(xì)胞污染。在運(yùn)用無血清法培養(yǎng)后，可見GFAP陰性細(xì)胞顯著減少，表明無血清培養(yǎng)法可有效去除成纖維細(xì)胞污染。Smith等［9］的文章中并未統(tǒng)計(jì)原代細(xì)胞純度，本實(shí)驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)GFAP陽性細(xì)胞占比超過98%，95%CI為(95.70，101.2)，表明純度較高，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]無血清饑餓法去除神經(jīng)組織培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞[J]. 歷俊華,萬虹,翟晶,王忠誠.  首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2004(02)



本文編號：3220685