發(fā)布時間：2021-06-01 01:30

　　目的:制備抗人前列腺癌特異性抗原（t-PSA）單克隆抗體,建立t-PSA的化學(xué)發(fā)光CLIA檢測方法。方法:t-PSA抗原免疫小鼠后,通過細(xì)胞融合、HTS篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)及親和純化后得到t-PSA單克隆抗體（mAb）,測定抗體親和力、特異性及表位,最后選擇抗不同表位的單克隆抗體建立雙抗體夾心CLIA檢測方法。結(jié)果:獲得4株陽性信號較強(qiáng)的抗人t-PSA的mAb（3-21-1、3-26-1、3-40-1、3-41-1）。用3-21-1 mAb-HRP和3-26-1 mAb-HRP建立的CLIA體系檢測范圍為0.1～100 ng/ml,最低檢測限為0.09 ng/ml,相對偏差均在±5%之內(nèi),與腫瘤標(biāo)志物CEA、AFP、Myo無交叉反應(yīng)。與羅氏試劑檢測t-PSA結(jié)果對比,一致性檢驗(yàn)KAPPA系數(shù)為0.933,相關(guān)系數(shù)為0.936,兩組數(shù)據(jù)具有較好的一致性和相關(guān)性。結(jié)論:本研究成功制備了抗人t-PSA mAb,建立了定量檢測t-PSA的雙抗體夾心CLIA方法。 

【文章來源】：中國免疫學(xué)雜志. 2019,35(13)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

抗t-PSA單克隆抗體的制備流程Fig．1Preparationprocessofanti-t-PSAmAb

亓矗??25kD左右清晰可見單抗的輕鏈，如圖3所示。2.2.2特異性鑒定t-PSA包含f-PSA、c-PSA，因此選定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外選取2種普遍的癌癥篩查蛋白AFP和CEA包被，對純化后的抗體采用間接ELISA方法測定其OD值。如圖4所示，4種單克隆抗體均不與AFP和CEA有交叉反應(yīng)，而與目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有陽性反應(yīng)。2.2.3親和力測定將3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb應(yīng)用BiacoreX100進(jìn)行圖2t-PSA第3次免疫小鼠后的效價Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice圖3SDS-PAGE檢測純化后t-PSA單克隆抗體Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗體親和力測定，其親和力均達(dá)10－10，結(jié)果如表1。2.2.4表位競爭鑒定將3-26-1mAb進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，測定其最佳工作濃度為1∶1×104。將t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP與其他3株抗體進(jìn)行競爭ELISA反應(yīng)，結(jié)果如圖5，3-26-1mAb與3-41-1mAb有競爭，與3-21-1mAb、3-40-1mAb都沒有競爭反應(yīng)，即3-26-1mAb與3-21-1mAb、3-40-1mAb分別針對t-PSA不同表位，可以進(jìn)行夾心反應(yīng)。2.2.5抗體的亞型鑒定篩選到的4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈，3-21-1mAb與3-40-1mAb的重鏈為IgG2a，3-26-1mAb與3-41-1mAb重鏈為IgG2b。2.3夾心CLIA檢測t-PSA方法的建立及評價圖4t-PSA單克隆抗體與相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)Fig．

包含f-PSA、c-PSA，因此選定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外選取2種普遍的癌癥篩查蛋白AFP和CEA包被，對純化后的抗體采用間接ELISA方法測定其OD值。如圖4所示，4種單克隆抗體均不與AFP和CEA有交叉反應(yīng)，而與目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有陽性反應(yīng)。2.2.3親和力測定將3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb應(yīng)用BiacoreX100進(jìn)行圖2t-PSA第3次免疫小鼠后的效價Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice圖3SDS-PAGE檢測純化后t-PSA單克隆抗體Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗體親和力測定，其親和力均達(dá)10－10，結(jié)果如表1。2.2.4表位競爭鑒定將3-26-1mAb進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，測定其最佳工作濃度為1∶1×104。將t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP與其他3株抗體進(jìn)行競爭ELISA反應(yīng)，結(jié)果如圖5，3-26-1mAb與3-41-1mAb有競爭，與3-21-1mAb、3-40-1mAb都沒有競爭反應(yīng)，即3-26-1mAb與3-21-1mAb、3-40-1mAb分別針對t-PSA不同表位，可以進(jìn)行夾心反應(yīng)。2.2.5抗體的亞型鑒定篩選到的4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈，3-21-1mAb與3-40-1mAb的重鏈為IgG2a，3-26-1mAb與3-41-1mAb重鏈為IgG2b。2.3夾心CLIA檢測t-PSA方法的建立及評價圖4t-PSA單克隆抗體與相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)Fig．4Cross-reactionanalysisofanti-t-PSAmonoclonalantibodywithrelatedprotein表1anti-

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血清前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體p2PSA的體外穩(wěn)定性評估[J]. 巫志宇,羅杰,吳斌,陳鳴.  免疫學(xué)雜志. 2018(04)
[2]抗人CA15-3單克隆抗體的制備、鑒定及化學(xué)發(fā)光檢測體系的建立[J]. 曹領(lǐng)改,藍(lán)興國,魏德強(qiáng),李玉花.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2014(01)
[3]抗人β-HCG單克隆抗體的制備及化學(xué)發(fā)光檢測方法的建立[J]. 關(guān)雪,劉福剴,楊昕蕾,陳劍鋒,楊永良,梁重陽.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2014(01)



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