發(fā)布時(shí)間：2021-06-01 01:30

　　目的:制備抗人前列腺癌特異性抗原（t-PSA）單克隆抗體,建立t-PSA的化學(xué)發(fā)光CLIA檢測(cè)方法。方法:t-PSA抗原免疫小鼠后,通過(guò)細(xì)胞融合、HTS篩選、擴(kuò)大培養(yǎng)及親和純化后得到t-PSA單克隆抗體（mAb）,測(cè)定抗體親和力、特異性及表位,最后選擇抗不同表位的單克隆抗體建立雙抗體夾心CLIA檢測(cè)方法。結(jié)果:獲得4株陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)的抗人t-PSA的mAb（3-21-1、3-26-1、3-40-1、3-41-1）。用3-21-1 mAb-HRP和3-26-1 mAb-HRP建立的CLIA體系檢測(cè)范圍為0.1～100 ng/ml,最低檢測(cè)限為0.09 ng/ml,相對(duì)偏差均在±5%之內(nèi),與腫瘤標(biāo)志物CEA、AFP、Myo無(wú)交叉反應(yīng)。與羅氏試劑檢測(cè)t-PSA結(jié)果對(duì)比,一致性檢驗(yàn)KAPPA系數(shù)為0.933,相關(guān)系數(shù)為0.936,兩組數(shù)據(jù)具有較好的一致性和相關(guān)性。結(jié)論:本研究成功制備了抗人t-PSA mAb,建立了定量檢測(cè)t-PSA的雙抗體夾心CLIA方法。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2019,35(13)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

抗t-PSA單克隆抗體的制備流程Fig．1Preparationprocessofanti-t-PSAmAb

亓矗??25kD左右清晰可見(jiàn)單抗的輕鏈，如圖3所示。2.2.2特異性鑒定t-PSA包含f-PSA、c-PSA，因此選定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外選取2種普遍的癌癥篩查蛋白AFP和CEA包被，對(duì)純化后的抗體采用間接ELISA方法測(cè)定其OD值。如圖4所示，4種單克隆抗體均不與AFP和CEA有交叉反應(yīng)，而與目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有陽(yáng)性反應(yīng)。2.2.3親和力測(cè)定將3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb應(yīng)用BiacoreX100進(jìn)行圖2t-PSA第3次免疫小鼠后的效價(jià)Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice圖3SDS-PAGE檢測(cè)純化后t-PSA單克隆抗體Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗體親和力測(cè)定，其親和力均達(dá)10－10，結(jié)果如表1。2.2.4表位競(jìng)爭(zhēng)鑒定將3-26-1mAb進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，測(cè)定其最佳工作濃度為1∶1×104。將t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP與其他3株抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，結(jié)果如圖5，3-26-1mAb與3-41-1mAb有競(jìng)爭(zhēng)，與3-21-1mAb、3-40-1mAb都沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，即3-26-1mAb與3-21-1mAb、3-40-1mAb分別針對(duì)t-PSA不同表位，可以進(jìn)行夾心反應(yīng)。2.2.5抗體的亞型鑒定篩選到的4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈，3-21-1mAb與3-40-1mAb的重鏈為IgG2a，3-26-1mAb與3-41-1mAb重鏈為IgG2b。2.3夾心CLIA檢測(cè)t-PSA方法的建立及評(píng)價(jià)圖4t-PSA單克隆抗體與相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)Fig．

包含f-PSA、c-PSA，因此選定t-PSA、f-PSA和c-PSA蛋白包被［14］，另外選取2種普遍的癌癥篩查蛋白AFP和CEA包被，對(duì)純化后的抗體采用間接ELISA方法測(cè)定其OD值。如圖4所示，4種單克隆抗體均不與AFP和CEA有交叉反應(yīng)，而與目的蛋白t-PSA、f-PSA和c-PSA有陽(yáng)性反應(yīng)。2.2.3親和力測(cè)定將3-21-1mAb、3-26-1mAb、3-40-1mAb和3-41-1mAb應(yīng)用BiacoreX100進(jìn)行圖2t-PSA第3次免疫小鼠后的效價(jià)Fig．2Titerafterthirdt-PSAimmunizationinmice圖3SDS-PAGE檢測(cè)純化后t-PSA單克隆抗體Fig．3SDS-PAGEanalysisofanti-t-PSAmonoclonalanti-bodyafterpurificationNote:M.Molecularweightmarker;1.3-21-1mAb;2.3-26-1mAb;3.3-40-1mAb;4.3-41-1mAb.抗體親和力測(cè)定，其親和力均達(dá)10－10，結(jié)果如表1。2.2.4表位競(jìng)爭(zhēng)鑒定將3-26-1mAb進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，測(cè)定其最佳工作濃度為1∶1×104。將t-PSA蛋白包被，用3-26-1-HRP與其他3株抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，結(jié)果如圖5，3-26-1mAb與3-41-1mAb有競(jìng)爭(zhēng)，與3-21-1mAb、3-40-1mAb都沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，即3-26-1mAb與3-21-1mAb、3-40-1mAb分別針對(duì)t-PSA不同表位，可以進(jìn)行夾心反應(yīng)。2.2.5抗體的亞型鑒定篩選到的4株單克隆抗體的輕鏈均為κ鏈，3-21-1mAb與3-40-1mAb的重鏈為IgG2a，3-26-1mAb與3-41-1mAb重鏈為IgG2b。2.3夾心CLIA檢測(cè)t-PSA方法的建立及評(píng)價(jià)圖4t-PSA單克隆抗體與相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)Fig．4Cross-reactionanalysisofanti-t-PSAmonoclonalantibodywithrelatedprotein表1anti-

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]血清前列腺特異性抗原同源異構(gòu)體p2PSA的體外穩(wěn)定性評(píng)估[J]. 巫志宇,羅杰,吳斌,陳鳴.  免疫學(xué)雜志. 2018(04)
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本文編號(hào)：3209387