目的原核表達(dá)豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。方法參照GenBank中Ts8B2基因序列設(shè)計(jì)引物,以合成基因?yàn)槟０瀚@得預(yù)期DNA片段,雙酶切后連接至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α（E.coli DH5α）,PCR、雙酶切篩選陽(yáng)性質(zhì)粒,測(cè)序確認(rèn)后轉(zhuǎn)化至E.coli Rosstea,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。尿素法提取重組蛋白,然后以腦囊蟲(chóng)病患者血清為一抗,Western blot分析其免疫反應(yīng)性。結(jié)果 Ts8B2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為258 bp,與理論值一致。雙酶切和測(cè)序鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為3.5×10³,以包涵體形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重組蛋白能被腦囊蟲(chóng)患者血清識(shí)別。結(jié)論成功構(gòu)建Ts8B2基因重組表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的重組蛋白具有免疫反應(yīng)性,為進(jìn)一步研究該蛋白在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019,14(02)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＴｓ８Ｂ２ｇｅｎｅＭＤＮＡ標(biāo)志物１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物

Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２的構(gòu)建及鑒定Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切純化后用Ｔ４連接酶連接到原核表達(dá)載體ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，雙酶切后得到約２５０ｂｐ的酶切目的片段（圖２），與Ｔｓ８Ｂ２基因大小基本相符。測(cè)序顯示重組質(zhì)粒插入序列與目的序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。ＭＤＮＡ標(biāo)志物１重組質(zhì)粒的ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切圖２重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＢａｍＨⅠａｎｄＸｈｏⅠＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２轉(zhuǎn)化表達(dá)菌Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｓｔｅａ（命名為ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ）后經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖３。重組菌高效表達(dá)的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為３５×１０３（目的蛋白為９．８×１０３，ＧＳＴ標(biāo)簽蛋白為２６×１０３），與預(yù)期值相符�？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ誘導(dǎo)后無(wú)此蛋白條帶。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ對(duì)照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ圖３重組蛋白ｒＴ

／Ｒｏｓｓｔｅａ）后經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖３。重組菌高效表達(dá)的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為３５×１０３（目的蛋白為９．８×１０３，ＧＳＴ標(biāo)簽蛋白為２６×１０３），與預(yù)期值相符�？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ誘導(dǎo)后無(wú)此蛋白條帶。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ對(duì)照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ圖３重組蛋白ｒＴｓ８Ｂ２的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧ２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧｆｏｒ４ｈＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４ｒＴｓ８Ｂ２的純化超聲裂解ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ顯示重組蛋白ｒＴｓ８Ｂ２以包涵體的形式存在于菌體中。對(duì)包涵體進(jìn)行純化復(fù)性，純化后的蛋白進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結(jié)果見(jiàn)圖４。純化的重組蛋白分子質(zhì)量與理論值吻合且為單一條帶。ＢＣＡ法測(cè)定純化的蛋白濃度為１．４ｍｇ／ｍｌ。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)２純化的ｒＴｓ８Ｂ２圖４純化的ｒＴｓ８Ｂ２ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｅｄｒＴｓ８Ｂ２Ｆｉｇ．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ５ｒＴ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗豬囊尾蚴IgG4抗體的特異性抗原篩選[J]. 李瑾,王燕,魏慶寬,賈鳳菊,肖婷,孫慧,于振華,黃炳成.  中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志. 2017(05)
[2]豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表達(dá)、純化以及免疫反應(yīng)性分析[J]. 李瑾,肖婷,孫慧,魏慶寬,賈鳳菊,黃炳成.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2018(05)
[3]豬帶絳蟲(chóng)重組BCG-TSOL18疫苗的穩(wěn)定性研究[J]. 江楠,楊鳳嬌,周必英.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2017(02)
[4]豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白基因的原核表達(dá)和免疫學(xué)分析[J]. 鐘樹(shù)懷,方文.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2015(01)
[5]豬囊尾蚴病重組DNA疫苗pcDNA 3.1-TSO45W在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫效應(yīng)[J]. 王媛媛,楊小迪,孫新,陶志勇,常雪蓮,王小莉,方強(qiáng),夏惠.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2014(03)



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