目的原核表達豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。方法參照GenBank中Ts8B2基因序列設(shè)計引物,以合成基因為模板獲得預(yù)期DNA片段,雙酶切后連接至原核表達載體pGEX-4T-1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α（E.coli DH5α）,PCR、雙酶切篩選陽性質(zhì)粒,測序確認后轉(zhuǎn)化至E.coli Rosstea,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測表達產(chǎn)物。尿素法提取重組蛋白,然后以腦囊蟲病患者血清為一抗,Western blot分析其免疫反應(yīng)性。結(jié)果 Ts8B2基因PCR擴增產(chǎn)物為258 bp,與理論值一致。雙酶切和測序鑒定重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功,SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌表達相對分子質(zhì)量為3.5×10³,以包涵體形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重組蛋白能被腦囊蟲患者血清識別。結(jié)論成功構(gòu)建Ts8B2基因重組表達質(zhì)粒表達的重組蛋白具有免疫反應(yīng)性,為進一步研究該蛋白在抗體檢測中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(02)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

圖１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴增結(jié)果ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＴｓ８Ｂ２ｇｅｎｅＭＤＮＡ標志物１Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴增產(chǎn)物

Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２的構(gòu)建及鑒定Ｔｓ８Ｂ２基因ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切純化后用Ｔ４連接酶連接到原核表達載體ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，雙酶切后得到約２５０ｂｐ的酶切目的片段（圖２），與Ｔｓ８Ｂ２基因大小基本相符。測序顯示重組質(zhì)粒插入序列與目的序列一致，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。ＭＤＮＡ標志物１重組質(zhì)粒的ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切圖２重組表達質(zhì)粒酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｙＢａｍＨⅠａｎｄＸｈｏⅠＦｉｇ．２Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｌａｓｍｉｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ３重組蛋白的誘導(dǎo)表達及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重組質(zhì)粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２轉(zhuǎn)化表達菌Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｓｔｅａ（命名為ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ）后經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測表達產(chǎn)物，結(jié)果見圖３。重組菌高效表達的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相對分子質(zhì)量為３５×１０３（目的蛋白為９．８×１０３，ＧＳＴ標簽蛋白為２６×１０３），與預(yù)期值相符�？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ誘導(dǎo)后無此蛋白條帶。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標準１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ對照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ圖３重組蛋白ｒＴ

／Ｒｏｓｓｔｅａ）后經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測表達產(chǎn)物，結(jié)果見圖３。重組菌高效表達的ｒＴｓ８Ｂ２蛋白相對分子質(zhì)量為３５×１０３（目的蛋白為９．８×１０３，ＧＳＴ標簽蛋白為２６×１０３），與預(yù)期值相符�？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ誘導(dǎo)后無此蛋白條帶。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標準１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ｒｏｓｓｔｅａ對照２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ經(jīng)ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ圖３重組蛋白ｒＴｓ８Ｂ２的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧ２ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／ＲｏｓｓｔｅａｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙＩＰＴＧｆｏｒ４ｈＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｃａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４ｒＴｓ８Ｂ２的純化超聲裂解ＩＰＴＧ誘導(dǎo)４ｈ的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１－Ｔｓ８Ｂ２／Ｒｏｓｓｔｅａ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ顯示重組蛋白ｒＴｓ８Ｂ２以包涵體的形式存在于菌體中。對包涵體進行純化復(fù)性，純化后的蛋白進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結(jié)果見圖４。純化的重組蛋白分子質(zhì)量與理論值吻合且為單一條帶。ＢＣＡ法測定純化的蛋白濃度為１．４ｍｇ／ｍｌ。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標準２純化的ｒＴｓ８Ｂ２圖４純化的ｒＴｓ８Ｂ２ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｅｄｒＴｓ８Ｂ２Ｆｉｇ．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ５ｒＴ

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]豬囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B3基因的原核表達、純化以及免疫反應(yīng)性分析[J]. 李瑾,肖婷,孫慧,魏慶寬,賈鳳菊,黃炳成.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(05)
[3]豬帶絳蟲重組BCG-TSOL18疫苗的穩(wěn)定性研究[J]. 江楠,楊鳳嬌,周必英.  中國病原生物學(xué)雜志. 2017(02)
[4]豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白基因的原核表達和免疫學(xué)分析[J]. 鐘樹懷,方文.  中國病原生物學(xué)雜志. 2015(01)
[5]豬囊尾蚴病重組DNA疫苗pcDNA 3.1-TSO45W在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫效應(yīng)[J]. 王媛媛,楊小迪,孫新,陶志勇,常雪蓮,王小莉,方強,夏惠.  中國病原生物學(xué)雜志. 2014(03)



本文編號：3208850