本文關(guān)鍵詞：圓圃棘口吸蟲分子種系發(fā)生的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：圓圃棘口吸蟲(Echinostoma hortense)隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)、吸蟲綱(Trematoda)、復(fù)殖亞綱(Digenea)、棘口目(Echinostomata)、棘口科(Echinostomatidae)、棘口屬(Echinostoma),是寄生于哺乳類等動物小腸內(nèi)的吸蟲。圓圃棘口吸蟲的主要終末宿主有鼠、犬、貓以及豬。當感染圓圃棘口吸蟲時會引起動物消瘦、貧血和營養(yǎng)障礙,嚴重者可以引起死亡。而且圓圃棘口吸蟲也可以寄生于人,是一種重要的人獸共患病病原。圓圃棘口吸蟲主要流行于韓國、日本、中國以及東南亞各國。目前對圓圃棘口吸蟲的研究主要集中于傳統(tǒng)寄生蟲學(xué)方面,如形態(tài)學(xué)、生活史及疾病的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和綜合防治等;在分子水平上僅對核糖體ITS1以及線粒體cox1和nad1部分序列有所研究報道,而對核糖體其他基因和線粒體全基因組的研究還未見報道,因此,本研究針對這一空白展開研究。從自然感染病犬的小腸內(nèi)采集蟲體,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為圓圃棘口吸蟲。利用SDS-蛋白酶K法抽提圓圃棘口吸蟲基因組DNA。首先,通過與GenBank上已發(fā)表的相關(guān)棘口目吸蟲線粒體基因組序列比對,利用Oligo 7.3軟件設(shè)計出7對特異性引物,PCR擴增線粒體各基因,序列拼接后對線粒體全基因組進行序列分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,探討圓圃棘口吸蟲在吸蟲中的分子進化地位。然后再設(shè)計4對特異性引物,擴增5條圓圃棘口吸蟲的核糖體18S、ITS1、5.8S、ITS2以及28S序列,運用分子生物學(xué)方法,對這5條圓圃棘口吸蟲的5個序列的大小,堿基組成進行比對分析,并基于核糖體18S、ITS1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,分析圓圃棘口吸蟲與其他吸蟲間的進化關(guān)系。結(jié)果表明:所獲得的圓圃棘口吸蟲線粒體全基因組由22個tRNA基因、12個蛋白質(zhì)編碼基因、2個核糖體亞基基因和1個非編碼區(qū)組成,大小為14,994 bp,編碼蛋白質(zhì)基因、核糖體亞基基因和非編碼區(qū)序列長分別為10,047 bp,1,732bp和1,553 bp。整個線粒體基因組核苷酸組成為:T(41.69%)G(24.79%)A(21.36%)C(12.16%),AT含量為63.05%。圓圃棘口吸蟲的基因排列(含核糖體大小亞基不含非編碼區(qū))屬GO4型。以串聯(lián)的12個蛋白質(zhì)編碼基因為基因標記,采用BI、MP和ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果相似,進化樹分為二個大的分支,Clinostomoidea目平坦彎口吸蟲(Clinostomum complanatum)獨立成一進化分支,后睪目、棘口目和斜睪目為另一分支。圓圃棘口吸蟲位于棘口目獨立的進化分支上,說明線粒體全基因序列是研究寄生蟲分子種系發(fā)生的良好基因標記。擴增獲得的5條圓圃棘口吸蟲的核糖體18S、ITS1、5.8S、ITS2以及28S序列,總長度均為為6,810 bp,且5條蟲體18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S長度均未發(fā)生變化,分別為1,981 bp、444 bp、162 bp、440 bp和3,783 bp。比較發(fā)現(xiàn)5段基因的變異率分別為:0~0.1%、0~0.20%、0%、0~0.20%、0%。分別以核糖體18S和ITS1序列為標記基因,采用BI、MP和ML三種方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果相似,進化樹分為二個大的分支,梟形目為一獨立進化分支,棘口目、后睪目和斜睪目為另一分支。圓圃棘口吸蟲位于棘口目的進化分支上,與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類一致,且與Isthmiophora hortensis在同一進化分支。表明核糖體18S和ITS1序列是研究寄生蟲分子種系發(fā)生的良好基因標記。本研究首次獲得了圓圃棘口吸蟲線粒體全基因組,對線粒體基因組及核糖體18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S進行了分析,并基于線粒體12個蛋白質(zhì)編碼基因和核糖體18S、ITS1序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹從分子水平上探討了圓圃棘口吸蟲與其他吸蟲的進化關(guān)系。本研究豐富了吸蟲線粒體、核糖體基因資料,為進一步研究棘口吸蟲的分類、系統(tǒng)發(fā)生及圓圃棘口吸蟲的起源奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：圓圃棘口吸蟲 線粒體全基因組 核糖體18S 核糖體ITS1 進化分析
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R383.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻綜述12-38
• 1.1 圓圃棘口吸蟲及圓圃棘口吸蟲病12-16
• 1.1.1 病原形態(tài)13-14
• 1.1.2 生活史14
• 1.1.3 流行病學(xué)14-15
• 1.1.4 圓圃棘口吸蟲病的癥狀及危害15-16
• 1.1.5 圓圃棘口吸蟲病的防控16
• 1.2 吸蟲線粒體基因組研究進展16-27
• 1.2.1 吸蟲線粒體基因組全序列測定完成概況17-19
• 1.2.2 吸蟲線粒體基因組的特點19-27
• 1.3 吸蟲核糖體DNA研究進展27-35
• 1.3.1 吸蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的研究進展28-32
• 1.3.2 吸蟲 18S、28S核糖體序列的研究進展32-35
• 1.4 線粒體基因組和核糖體序列的用途35-36
• 1.5 研究的目的與意義36-38
• 第二章 圓圃棘口吸蟲線粒體全基因組擴增與進化分析38-64
• 2.1 材料與方法38-46
• 2.1.1 材料38-39
• 2.1.2 方法39-46
• 2.2 圓圃棘口吸蟲線粒體全基因組各段基因擴增與拼接46-49
• 2.2.1 圓圃棘口吸蟲EHM-1 基因序列PCR結(jié)果46
• 2.2.2 圓圃棘口吸蟲EHM-2 基因序列PCR結(jié)果46-47
• 2.2.3 圓圃棘口吸蟲EHM-3 基因序列PCR結(jié)果47
• 2.2.4 圓圃棘口吸蟲EHM-4 基因序列PCR結(jié)果47
• 2.2.5 圓圃棘口吸蟲EHM-5 基因序列PCR結(jié)果47-48
• 2.2.6 圓圃棘口吸蟲EHM-6 基因序列PCR結(jié)果48
• 2.2.7 圓圃棘口吸蟲EHM-7 基因序列PCR結(jié)果48-49
• 2.2.8 圓圃棘口吸蟲線粒體基因序列拼接49
• 2.3 圓圃棘口吸蟲線粒體分析49-56
• 2.3.1 圓圃棘口吸蟲線粒體全基因組的特征49-53
• 2.3.2 圓圃棘口吸蟲線粒體中基因的排列順序和密碼子的使用53-55
• 2.3.3 圓圃棘口吸蟲線粒體中的tRNA和rrnA55-56
• 2.3.4 圓圃棘口吸蟲線粒體的非編碼區(qū)56
• 2.3.5 進化分析56
• 2.4 討論56-64
• 2.4.1 圓圃棘口吸蟲線粒體結(jié)構(gòu)特點56-58
• 2.4.2 圓圃棘口吸蟲線粒體蛋白質(zhì)編碼基因58-59
• 2.4.3 圓圃棘口吸蟲線粒體密碼子的使用59
• 2.4.4 圓圃棘口吸蟲線粒體中RNA的分析59-60
• 2.4.5 圓圃棘口吸蟲非編碼區(qū)60-61
• 2.4.6 系統(tǒng)進化分析61-64
• 第三章 圓圃棘口吸蟲核糖體序列的擴增與進化分析64-80
• 3.1 材料與方法64-67
• 3.1.1 材料64
• 3.1.2 方法64-67
• 3.2 圓圃棘口吸蟲核糖體各部分PCR結(jié)果與拼接67-69
• 3.2.1 圓圃棘口吸蟲EHR-1 基因序列PCR結(jié)果67
• 3.2.2 圓圃棘口吸蟲EHR-2 基因序列PCR結(jié)果67
• 3.2.3 圓圃棘口吸蟲EHR-3 基因序列PCR結(jié)果67-68
• 3.2.4 圓圃棘口吸蟲EHR-4 基因序列PCR結(jié)果68-69
• 3.2.5 圓圃棘口吸蟲核糖體基因序列拼接69
• 3.3 圓圃棘口吸蟲核糖體分析69-75
• 3.3.1 圓圃棘口吸蟲核糖體序列分析69-72
• 3.3.2 基于圓圃棘口吸蟲核糖體 18S和ITS1序列構(gòu)建進化樹72-75
• 3.4 討論75-80
• 3.4.1 圓圃棘口吸蟲核糖體的結(jié)構(gòu)特征75-76
• 3.4.2 基于核糖體 18S、ITS1構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹76-80
• 第四章 結(jié)論80-82
• 附錄82-86
• 附錄 182-84
• 附錄 284-86
• 參考文獻86-98
• 致謝98-100
• 個人簡歷100-101

【參考文獻】

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本文編號：318664