發(fā)布時間：2021-05-08 13:21

　　目的胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）可激活核因子?κB（NF?κB）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）等通路參與免疫,但其作用機制至今尚未闡明。為進行相關(guān)體外實驗,構(gòu)建CARD9?麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合蛋白的原核表達載體,并對融合蛋白進行表達鑒定及純化。方法利用PCR技術(shù)分別擴增CARD9和MBP基因的編碼序列,將兩者正確插入pET?30a（+）載體中得到重組質(zhì)粒,后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中,并進行PCR和酶切鑒定以及基因測序。將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞,篩選不同條件進行IPTG誘導(dǎo)表達,通過SDS?PAGE電泳檢測目的蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。通過MBP麥芽糖層析柱和分子篩層析柱對CARD9?MBP融合蛋白進行純化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP標(biāo)簽后進行MALDI?TOF質(zhì)譜鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建CARD9?MBP融合蛋白的原核表達載體,PCR和酶切鑒定為陽性且基因測序結(jié)果與目的序列一致。SDS?PAGE電泳顯示,在大腸埃希菌BL21（DE3）中成功誘導(dǎo)表達出相對分子質(zhì)量約為105 000的目的蛋白。通過MBP麥芽糖層析柱的初步純化... 

【文章來源】：醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2019,32(03)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
0 引言
1 材料與方法
    1.1 LB培養(yǎng)基
    1.2 主要試劑和儀器
    1.3 方法
        1.3.1 目的基因的擴增
        1.3.2 重組質(zhì)粒pET-30a (+) -CARD9-MBP的構(gòu)建及鑒定
        1.3.3 不同誘導(dǎo)條件下CARD9-MBP融合蛋白的表達
        1.3.4 CARD9-MBP融合蛋白的MBP層析純化
        1.3.5 CARD9-MBP融合蛋白的蛋白酶酶切
        1.3.6 CARD9-MBP融合蛋白的分子篩層析純化
2 結(jié)果
    2.1 目的基因的擴增
    2.2 重組質(zhì)粒pET-30a (+) -CARD9-MBP的構(gòu)建及鑒定
    2.3 CARD9-MBP融合蛋白的表達
    2.4 CARD9-MBP融合蛋白的MBP層析純化
    2.5 CARD9-MBP融合蛋白的HRV3C蛋白酶酶切
    2.6 CARD9-MBP融合蛋白的分子篩層析純化
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]功能性受體鈉離子牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白-Huh7細胞株的構(gòu)建及其HBV易感性[J]. 朱甜甜,李毓雯,胡平平,李軍,朱傳龍.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2018(11)
[2]Tiam1截短體融合蛋白的原核表達與純化[J]. 黃靜,張余琴,陳龍華,丁軼.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報. 2017(09)
[3]播散性暗色絲孢霉病患者CARD9突變及相關(guān)免疫學(xué)研究[J]. 張瑞珺,王曉雯,萬喆,李若瑜.  微生物與感染. 2017(01)
[4]胱天蛋白酶募集域蛋白9在胃癌中的表達及作用機制研究[J]. 林貴德,周春麗,何海春.  中國臨床研究. 2016(02)



本文編號：3175410