先天免疫又稱固有免疫或天然免疫,是機體防御病原體的第一道防線。在先天免疫系統(tǒng)中,不同吞噬細胞如嗜中性粒細胞和樹突細胞等通過來自Toll樣受體（TLR）的信號而辨別出病原體及“自己”。在啟動先天免疫對抗病原體的過程中最重要的一步就是識別,由殺傷細胞的受體識別存在于病原體而不存在于細胞中的成分,這稱為病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）。不同的TLR識別的PAMP不同,例如TLR4可以識別革蘭氏陰性菌的LPS。在這里,我們證明T細胞和IκB激酶復合體間的重要信號分子BCL10與先天免疫系統(tǒng)有關,并參與了TLR4途徑及核因子κB（NF-κB）的激活。BCL10作為一個在適應性免疫信號轉(zhuǎn)導中的信號分子,其在TCR通路中的作用機制已經(jīng)得到了很好的說明,我們的工作發(fā)現(xiàn),BCL10不僅在適應性免疫中具有信號轉(zhuǎn)導功能,而且在先天免疫中也有這種作用,它能在細菌LPS刺激下,參與LPS/TLR4途徑,最后引起NF-κB的活化,我們還提出了這條通路中針對BCL10的負反饋調(diào)節(jié)模型。在這里,我們對其作用機制進行了研究,發(fā)現(xiàn)在LPS刺激下,... 

【文章來源】：武漢大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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第一章 前言
    1. 先天免疫概述
        1.1 先天免疫的主要效應細胞
        1.2 先天免疫識別的基本模式
    2. Toll 樣受體（Toll-like receptor）
        2.1 TLR/IL-1R 受體超家族的結(jié)構(gòu)特點
            2.1.1 胞內(nèi)區(qū)的 TIR 結(jié)構(gòu)域
            2.1.2 胞外區(qū) LRR 序列
        2.2 Toll 家族成員在機體防御中的作用
        2.3 TLR4 及其配體
        2.4 TLR/IL-1R 信號通路
            2.4.1 MyD88 依賴的信號通路（MyD88-dependent pathway）
            2.4.2 非 MyD88 依賴的信號通路（MyD88-independent pathway）
            2.4.3 其它參加 TLR 信號通路的分子
    3. T淋巴細胞抗原受體的信號轉(zhuǎn)導
        3.1 TCR
        3.2 TCR 的信號轉(zhuǎn)導
            3.2.1 配體識別引起 TCR 聚集
            3.2.2 Src 家族蛋白酪氨酸激酶的活化
            3.2.3 TCR/CD3 胞漿區(qū)酪氨酸磷酸化
            3.2.4 Syk 家族蛋白酪氨酸激酶的募集和活化
            3.2.5 接頭分子的募集
            3.2.6 PKC 途徑中的下游分子
            3.2.7 NF-κB 的活化及轉(zhuǎn)錄的激活
    4. 轉(zhuǎn)錄因子
        4.1 NF-κB
            4.1.1 NF-κB 的結(jié)構(gòu)與組成
            4.1.2 IκB 家族
            4.1.3 IKK 激酶
            4.1.4 NF-κB 的活化
        4.2 P53
            4.2.1 P53 的結(jié)構(gòu)與功能
            4.2.2 P53 的活化及調(diào)節(jié)
        4.3 STAT 家族
            4.3.1 STAT 家族成員的組成與結(jié)構(gòu)
            4.3.2 STAT 蛋白的活化及調(diào)節(jié)
    5. Pellino 的研究
        5.1 Pellino1
        5.2 Pellino2
        5.3 Pellino3
    6. BCL10 的研究
        6.1 BCL10 的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)
        6.2 BCL10 的功能
            6.2.1 BCL10 能誘發(fā)細胞凋亡
            6.2.2 BCL10 能激活 NF-κB
            6.2.3 BCL10 能抑制細胞轉(zhuǎn)化
            6.2.4 BCL10 在免疫系統(tǒng)中的作用
            6.2.5 BCL10 與腫瘤的關系
    7. IRAK 的研究
        7.1 IRAK 蛋白家族成員的功能
        7.2 IRAK 分子在 TLR 信號通路中的正調(diào)節(jié)作用
        7.3 IRAK 分子在 TLR 信號通路中的負調(diào)節(jié)作用
        7.4 IRAK 成為了炎癥和感染疾病中新的藥物治療靶點
第二章 常規(guī)研究技術
    2.1 分子生物學實驗技術
        2.1.1 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
        2.1.2 質(zhì)粒 DNA 的大量制備
        2.1.3 質(zhì)粒 DNA 的純化
        2.1.4 DNA 限制性酶消化
        2.1.5 低熔點瓊脂糖凝膠法回收 DNA 片斷
        2.1.6 玻璃奶(glass-milk)法回收 DNA 片斷
        2.1.7 用試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收 DNA
        2.1.8 DNA 片段和載體的連接
        2.1.9 冷氯化鈣法制備新鮮感受態(tài)細胞
        2.1.10 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備
        2.1.11 質(zhì)粒 DNA 的常規(guī)轉(zhuǎn)化
        2.1.12 質(zhì)粒 DNA 的快速轉(zhuǎn)化法
        2.1.13 質(zhì)粒 DNA 的電轉(zhuǎn)化法
        2.1.14 PCR 擴增目的基因
        2.1.15 PCR 定點誘變
    2.2 細胞學實驗技術
        2.2.1 細胞培養(yǎng)基的配制
        2.2.2 細胞傳代培養(yǎng)
        2.2.3 細胞轉(zhuǎn)染
    2.3 分子生物學實驗技術
        2.3.1 用原核表達系統(tǒng)表達蛋白
        2.3.2 Bac-to-Bac 表達系統(tǒng)
            A. 目的基因的克隆
            B. 轉(zhuǎn)座
            C. 重組Bacmid DNA 的分離
            D. 重組穿梭載體Bacmid DNA 的提取制備
            E. PCR 鑒定
            F. Bacmid DNA 轉(zhuǎn)染 Sf-9 細胞
            G. 收獲重組病毒
            H. 重組病毒感染昆蟲細胞
        2.3.3 Ni++親和層析法純化蛋白質(zhì)
        2.3.4 免疫共沉淀
        2.3.5 Western Blot
        2.3.6 GST 樹脂pull-down 分析
        2.3.7 T7 Select 噬菌體展示技術
            A 噬菌體展示技術篩選流程
            B 陽性克隆的篩選方法
            C 噬菌體 DNA 的制備
        2.3.8 RNA 干擾
第三章 BCL10 與 Pellino2 的結(jié)合對 LPS/TLR4 信號通路的調(diào)控
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 質(zhì)粒與細胞
        3.2.2 抗體，試劑及文庫
        3.2.3 RAW264.7 細胞的培養(yǎng)
        3.2.4 RNA 干擾
    3.3 研究結(jié)果
        3.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        3.3.2 BCL10 在原核細胞中的表達
        3.3.3 BCL10 蛋白的純化
        3.3.4 BCL10 相互作用蛋白的篩選
        3.3.5 LPS 刺激下 BCL10 與 Pellino2 的相互作用
        3.3.6 LPS 處理或過表達 BCL10 的條件下 Pellino2 引發(fā)的 NF-κB 活化
        3.3.7 BCL10 是 LPS 誘導 NF-κB 活化的關鍵信號分子
        3.3.8 LPS 招募 BCL10 到 TLR4 信號復合物上
        3.3.9 SOCS3 對 BCL10 誘導的 NF-κB 活化和iNOS 表達有負調(diào)控作用
        3.3.10 SOCS3 對 Pellino2 與 BCL10 的相互作用的負調(diào)控
        3.3.11 SOCS3 阻斷 TLR4 復合物對 BCL10 的招募
    3.4 討論
第四章 BCL10 與 IRAK1 的結(jié)合對 LPS/TLR4 信號途徑的調(diào)控
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 菌株、質(zhì)粒與細胞
        4.2.2 試劑、抗體及文庫
        4.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.4 PCR 定點誘變
        4.2.5 siRNA 靶序列的設計和siRNA 載體的構(gòu)建
        4.2.6 甘油梯度超速離心
    4.3 研究結(jié)果
        4.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        4.3.2 BCL10 蛋白的表達純化
        4.3.3 BCL10 相關蛋白的篩選
        4.3.4 LPS 刺激下內(nèi)源性 BCL10 與 IRAK1 的體內(nèi)相互作用
        4.3.5 IRAK1 與 BCL10 相互作用功能區(qū)的鑒定
        4.3.6 BCL10 與 IRAK1 相互作用功能區(qū)的鑒定
        4.3.7 IRAK1可以招募BCL10到TLR4受體復合物中
        4.3.8 BCL10 傳遞了 IRAK1 下游的信號
        4.3.9 BCL10 必須寡聚化后才能傳遞 LPS 信號
        4.3.10 IRAK1 的寡聚化引起 BCL10 的寡聚化
    4.4 討論
第五章 MALT1 與 Pellino2/BCL10 的結(jié)合對 LPS/TLR4 信號途徑的調(diào)控
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 質(zhì)粒、細胞抗體及試劑
        5.2.2 RNAi
        5.2.3 細胞漿和細胞膜成分的分離
    5.3 研究結(jié)果
        5.3.1 MALT1 參與了 LPS/TLR4 信號轉(zhuǎn)導
        5.3.2 MALT1 與細胞質(zhì)中 BCL10 和 TRAF6 的相互作用
        5.3.3 在 IRAK1 降解后,Pellino2 介導 BCL10 和 TRAF6 的作用
    5.4 討論
研究總結(jié)和創(chuàng)新點
參考文獻
博士期間發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3174938