本文關(guān)鍵詞：以斑馬魚為動物模型探討臭氧對于組織損傷后再生的作用及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：臨床研究表明,常見的皮膚外傷如擦傷、挫裂傷、切割傷、燒傷、燙傷和粘膜糜爛如宮頸炎等,臭氧治療較常規(guī)治療可加速其愈合速度；而對于臨床上難以治愈的感染性創(chuàng)口,如糖尿病下肢潰瘍、腸瘺、食管胸腔瘺等,臭氧治療則可促使創(chuàng)口愈合。亦有臨床實(shí)踐證實(shí),對于幽門螺桿菌引起的胃十二指腸潰瘍,臭氧治療可取得滿意療效。少有的臭氧相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)也指出,臭氧對于小鼠肝臟組織切除后的再生也有促進(jìn)作用。對于皮膚創(chuàng)面,不論是臭氧水沖洗、臭氧氣浴熏蒸治療還是臭氧水浸浴治療,創(chuàng)面感染率都可以得到預(yù)防及有效控制,并且創(chuàng)面愈合時間均比常規(guī)消毒時間短。國內(nèi)外動物實(shí)驗(yàn)證明,臭氧水局部沖洗,可促進(jìn)創(chuàng)面愈合。推測其原理除抗菌外,作用機(jī)制還可能為：①臭氧能促進(jìn)毛細(xì)血管開放和功能修復(fù)、提高紅細(xì)胞攜氧能力。②誘導(dǎo)細(xì)胞羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)及血紅素氧合酶-1(HO-1)的生成,激活機(jī)體氧化與抗氧化反應(yīng)。③刺激局部表皮生長因子EGF表達(dá)增多,TNF-α表達(dá)減少,加速組織細(xì)胞再生。④增加細(xì)胞血小板衍化生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)增加,從而加速創(chuàng)面愈合,但沒有刺激纖維母細(xì)胞生長因子表達(dá)的增加。以上研究結(jié)果均表明臭氧對于組織再生具有促進(jìn)作用,并且這種作用無明顯組織特異性。感染和組織損傷的先天免疫反應(yīng)在生物進(jìn)化過程中是高度保守的,即從低等生物到高等生物,其受損后發(fā)生的免疫反應(yīng)基本相同。這使斑馬魚成為理想的研究炎癥和創(chuàng)傷修復(fù)的動物模型。對于本實(shí)驗(yàn)最有利的特點(diǎn)為斑馬魚多個器官和組織都可以再生,尤其以尾鰭再生模型操作容易、結(jié)構(gòu)簡單和組織再生迅速。研究表明,當(dāng)成年斑馬魚的尾鰭被95%切除后,在2周左右的時間內(nèi)就可以快速完全再生。幼魚尾鰭切除后五天可完成完全再生。材料與方法斑馬魚模型建立：實(shí)驗(yàn)所需的野生型AB-wide及Tg(mpo:GFP)[19]型斑馬魚均由廣東省人類疾病及藥物斑馬魚模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。斑馬魚根據(jù)Westerfield提供的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)[20]。所有器材在使用之前均需高壓消毒。臭氧水配制：臭氧是一種極不穩(wěn)定的強(qiáng)氧化氣體,較氧氣易溶于水。臭氧水的制備直接由臭氧氣體持續(xù)注入水中五分鐘所得(高氧液體制備儀,前沿醫(yī)學(xué))。水中離子影響臭氧穩(wěn)定性加速臭氧降解,但純凈的dd H20對于幼魚生長及生存影響較大(附1),仍選擇含有離子的系統(tǒng)水為臭氧水的配制用水。實(shí)驗(yàn)用臭氧水濃度測定：臭氧水濃度測定：將新鮮配制的臭氧水與系統(tǒng)水按照1：0、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4的比例配制成臭氧水工作液,用臭氧水濃度測定試劑盒(DPD臭氧測定試劑盒,陸恒生物)半定量各比例臭氧水濃度。實(shí)驗(yàn)用臭氧水安全濃度測定：不同濃度臭氧水中72hpf AB-wide幼魚生存曲線：將72hpf AB-wide幼魚分為六個組,分別給予濃度為上述比例配制好的臭氧水處理,體式顯微鏡下于處理后每五分鐘記錄各組幼魚死亡數(shù)量,記錄1h。吖啶橙(細(xì)胞凋亡)染色：將72hpf AB-wide幼魚分為六個組,分別給予濃度為上述比例配制好的臭氧水處理10分鐘后,分別孵育在1ml濃度為5ug/mL的吖啶橙中染色半小時,再用PBST清洗三次后置于載玻片上應(yīng)用熒光顯微鏡觀察幼魚全身細(xì)胞凋亡情況[25]。觀察比較尾鰭生長：72hpf AB-wide型幼魚,在體視顯微鏡下用1ml注射器針頭沿體節(jié)末端垂直體長軸切除幼魚尾鰭(圖2.A),隨機(jī)分為a、b、c三組,分別給予系統(tǒng)水、單次臭氧水(僅給予一次臭氧水)及多次臭氧水(每12h更換新鮮臭氧水)處理,監(jiān)測水中臭氧濃度變化。于尾鰭切除后Oh、24h、48h、72h、120h(hpa),在顯微鏡下測量a、b、c三組幼魚尾鰭生長長度并進(jìn)行比較。尾鰭切除后中性粒細(xì)胞遷移：72hpf Tg(mpo:GFP)幼魚,按上述方式切除幼魚尾鰭,隨機(jī)分為兩組,分別給予系統(tǒng)水及臭氧水處理。于0.5、1、2、3hpa在共聚焦顯微鏡下觀察記錄遷移到尾鰭切口的中性粒細(xì)胞數(shù)量。熒光定量RT-PCR:72hpf AB-wide幼魚,按上述方式切除幼魚尾鰭,隨機(jī)分為兩組,分別給予系統(tǒng)水及多次臭氧水處理。于0、6、12、24、48、72hpa留取標(biāo)本,應(yīng)用trizol (Takara)法提取樣本RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行Q-PCR,測定目的基因的表達(dá)。Q-PCR儀采用Light Cycler Nano(Roche)及Sybr Green熒光染料(Takara)。Immunoblotting:72hpf AB-wide幼魚,按上述方式切除幼魚尾鰭,隨機(jī)分為兩組,分別給予系統(tǒng)水及多次臭氧水處理。于0、6、12、24、48、72hpa留取標(biāo)本,提取蛋白后應(yīng)用Western Blot檢測TNF-α表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)方法：所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行處理。尾鰭生長長度比較應(yīng)用協(xié)方差分析,尾鰭中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及Q-pcr結(jié)果統(tǒng)計(jì)應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P≤0.05可認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：臭氧水安全實(shí)驗(yàn)濃度：確定制備臭氧水的基礎(chǔ)用水：臭氧水極不穩(wěn)定,自身可以降解[27,28],且水中離子成分、液體溫度、液體PH值都可影響其降解速度,因此在實(shí)驗(yàn)之前首先就要確定配制臭氧水的基礎(chǔ)用水。首先,比較dd H2O與系統(tǒng)水飼養(yǎng)環(huán)境下幼魚生存率(附錄1),結(jié)果可見dd H2O幼魚生存率明顯低于系統(tǒng)水組,應(yīng)選用系統(tǒng)水作為配制臭氧水的基礎(chǔ)用水。一般飼養(yǎng)幼魚的系統(tǒng)水中都會加入亞甲藍(lán)抑菌,但臭氧可與亞甲藍(lán)反應(yīng),產(chǎn)物未知,所以實(shí)驗(yàn)用的幼魚都不可接觸亞甲藍(lán)。臭氧水實(shí)驗(yàn)安全濃度測定臭氧水濃度測定：當(dāng)臭氧水與系統(tǒng)水以1：0、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4混合后測得相應(yīng)的濃度分別為1.5、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05mg/L。不同濃度臭氧水中幼魚生存時間不同：當(dāng)臭氧水濃度大于0.2mg/L時,幼魚生存時間隨濃度降低而增加：當(dāng)臭氧水濃度≤0.2mg/L時,幼魚生存時間不受臭氧水濃度影響,且每12小時更換新鮮臭氧水不會對幼魚造成累加性損傷,生存率無差別。細(xì)胞損傷凋亡：臭氧為強(qiáng)氧化劑,溶于水后會造成斑馬魚幼魚全身組織器官的損傷。不同濃度臭氧水對于斑馬魚幼魚損傷不同。結(jié)果見臭氧水濃度越高,斑馬魚幼魚全身損傷越嚴(yán)重。該結(jié)果提示,當(dāng)臭氧水濃度為前一結(jié)果測得的安全濃度0.2mg/L時,臭氧水對于幼魚循環(huán)系統(tǒng)及尾鰭有輕微損傷,對其生存無影響。當(dāng)臭氧水濃度低于0.1mg/L,對斑馬魚幼魚無損傷。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可確定0.1mg/L為實(shí)驗(yàn)用臭氧水濃度。尾鰭生長長度比較在顯微鏡下觀察記錄a,b,c三組幼魚尾鰭切除后生長情況。尾鰭切除后24小時之內(nèi),a組未出現(xiàn)明顯再生修復(fù),bc兩組再生修復(fù)已開始；尾鰭切除后48h內(nèi),bc兩組尾鰭生長長度均大于a組；尾鰭切除后72小時,c組尾鰭已基本完成輪廓及鰭條再生,而ab兩組尾鰭在切除后120h才完成再生。在有標(biāo)尺的顯微鏡下測量記錄abc三組幼魚切除尾鰭后尾鰭生長長度。ab兩組各時間點(diǎn)尾鰭生長長度比較：0、24、72hpa兩組幼魚尾鰭長度無差別,48hpa兩組幼魚尾鰭長度有差別(p0.01)。即ab兩組幼魚48hpa尾鰭生長長度有差別,差別在72小時時消失。ac兩組各時間點(diǎn)尾鰭生長長度比較：0hpa兩組幼魚尾鰭長度無差別,24、48、72hpa兩組幼魚尾鰭長度有差別,相同時間點(diǎn)a組尾鰭長度較c組短(p0.0001)。即ac兩組幼魚從尾鰭切除后24小時開始,尾鰭生長長度一直有差別(P0.0001),差別持續(xù)到72小時以后。監(jiān)測臭氧水濃度：可見單次給藥組臭氧濃度隨時間推移逐漸降低,至48hpa濃度降為Omg/ml。多次給藥組臭氧濃度也隨時間逐漸降低,但由于每12h更換一次,藥物濃度始終不為Omg/ml。72hpf MPO-GFP尾鰭切除后中性粒細(xì)胞遷移：共聚焦顯微鏡拍攝：72hpf MPO-GFP尾鰭切除后0.5、1、2、3小時時中性粒細(xì)胞遷移至尾鰭創(chuàng)面?zhèn)�。結(jié)果可見(圖3.B),在0.5、2、3hpa,尾鰭切除后創(chuàng)口處中心粒細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組較對照組多(p0.01),1hpa尾鰭切除后創(chuàng)口處中心粒細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組較對照組多,但差別較其他時間點(diǎn)小(p0.05)。腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)腫瘤壞死因子作為炎癥反應(yīng)中的主要因子,一直被人們關(guān)注研究。臭氧相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),臭氧可以抑制腫瘤壞死因子的表達(dá)。而我們的結(jié)果證實(shí)臭氧并非單純抑制腫瘤壞死因子的表達(dá)。24hpa以內(nèi)為尾鰭切除后炎癥期,TNF-α作為炎癥因子,臭氧促進(jìn)其表達(dá)。24hpa以后為炎癥消退后的組織再生期,組織再生程序啟動,TNF-α主要作用表現(xiàn)為抑制再生,臭氧抑制其表達(dá)(圖4)。臭氧通過雙向調(diào)控TNF-α表達(dá)促進(jìn)組織再生。臭氧對于TNF-α的調(diào)控機(jī)制選取TNF-α上游基因IL-10、STAT3,以及受上述兩個基因調(diào)控的IL-1β作為目的基因。結(jié)果可見,STAT3在12hpa以后受IL-10調(diào)控,其表達(dá)趨勢與IL-10相同。IL-1β表達(dá)趨勢與其他文獻(xiàn)相同,并且與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的TNF-α表達(dá)趨勢基本一致；受STAT3調(diào)控,但該調(diào)控具有明顯的雙相性,即該通路調(diào)控與再生時間段有關(guān),24hpa為基本時間分界線。結(jié)論1.我們通過測定不同濃度臭氧水對于72hpf幼魚的機(jī)體損傷及生存影響,摸索出實(shí)驗(yàn)用臭氧水的安全濃度為0.1mg/L。該濃度既保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,又保證了臭氧效果最大化。2.利用上述模型,我們證實(shí)了臭氧水對于斑馬魚尾鰭再生具有促進(jìn)作用,且該作用在停止給藥后逐漸消失。即對照組、單次給藥組和多次給藥組三組幼魚尾鰭生長速度差別是由于臭氧作用時間長短不同引起的。3.臭氧在創(chuàng)傷修復(fù)早期促進(jìn)創(chuàng)面中性粒細(xì)胞遷移,加速尾鰭壞死細(xì)胞清除,促進(jìn)組織再生。本實(shí)驗(yàn)推翻了之前臭氧抑制組織炎癥的結(jié)論,論證了在組織損傷后再生早期,臭氧促進(jìn)了組織炎癥。4.臭氧對于TNF-α的調(diào)節(jié)為雙向調(diào)節(jié),該調(diào)節(jié)完全依從于組織再生的需要。本實(shí)驗(yàn)推翻了前人研究的臭氧抑制TNF-α的結(jié)論,驗(yàn)證了臭氧在組織損傷后再生早期促進(jìn)TNF-α的表達(dá),而在再生后期抑制]TNF-α的表達(dá)。5.嘗試性的探索了臭氧對于TNF-α的調(diào)控機(jī)制,論證了臭氧在組織損傷后再生后期通過調(diào)控IL-10的表達(dá)從而調(diào)控TNF-α,但該調(diào)控并不是唯一調(diào)控通路。
【關(guān)鍵詞】：臭氧 再生 斑馬魚 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R459.6
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-28
• 前言28-34
• 第一章 斑馬魚臭氧模型的建立34-41
• 1.1 研究內(nèi)容34
• 1.2 觀察指標(biāo)34
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 1.3.1 斑馬魚的飼育34-35
• 1.3.2 臭氧水配制35
• 1.3.3 臭氧水濃度測定35
• 1.3.4 實(shí)驗(yàn)用臭氧水安全濃度測定35-36
• 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理36
• 1.5 結(jié)果36-39
• 1.5.1 臭氧水安全實(shí)驗(yàn)濃度36
• 1.5.2 臭氧水實(shí)驗(yàn)安全濃度測定36-37
• 1.5.3 細(xì)胞損傷凋亡37-39
• 1.6 討論39-40
• 1.7 結(jié)論40-41
• 第二章 臭氧對斑馬魚尾鰭切除后再生的影響41-46
• 2.1 研究內(nèi)容41
• 2.2 觀察指標(biāo)41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法41
• 2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察比較尾鰭生長41
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理41
• 2.5 結(jié)果41-45
• 2.5.1 尾鰭生長長度比較41-45
• 2.6 討論45
• 2.7 結(jié)論45-46
• 第三章 臭氧通過調(diào)節(jié)TNF-α的表達(dá)促進(jìn)尾鰭再生46-63
• 3.1 研究內(nèi)容46
• 3.2 觀察指標(biāo)46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法46-53
• 3.3.1 中性粒細(xì)胞遷移46
• 3.3.2 TNF-α基因定量檢測46-53
• 3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理53
• 3.5 結(jié)果53-60
• 3.5.1 72hpf MPO-GFP尾鰭切除后中性粒細(xì)胞遷移53-55
• 3.5.2 腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)55-57
• 3.5.3 臭氧對于TNF-α的調(diào)控機(jī)制57-60
• 3.6 討論60-61
• 3.7 結(jié)論61-63
• 全文小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-77
• 英文縮寫詞表77-78
• 附錄78-79
• 成果79-80
• 致謝80-82

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：以斑馬魚為動物模型探討臭氧對于組織損傷后再生的作用及其機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：309522