發(fā)布時(shí)間：2021-03-21 12:55

　　目的:改善內(nèi)源性蛋白的免疫沉淀/免疫印跡分析中免疫沉淀抗體對(duì)免疫印跡檢測(cè)帶來(lái)的干擾。方法:收集培養(yǎng)的Hela細(xì)胞或FLAG標(biāo)記的S5b基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞,制備全細(xì)胞裂解液,分別加入特異性抗體沉淀S5b并洗脫,收集免疫復(fù)合物,通過(guò)SDS-PAGE分離,采用HRP標(biāo)記的TrueBlot抗體或常規(guī)二抗,對(duì)S5b及其相互作用蛋白（Rpt1和Rpt2）進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果:得到了清晰的S5b,Rpt1和Rpt2條帶。結(jié)論:TrueBlot抗體能明顯消除免疫沉淀抗體的干擾,是內(nèi)源性蛋白免疫沉淀后進(jìn)行免疫印跡分析的理想工具。 

【文章來(lái)源】：中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2014,39(07)北大核心CSCD

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外源性S5b的免疫共沉淀/免疫印跡分析

696中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,39(7)http://www.csumed.org2.2內(nèi)源性S5b的免疫沉淀分析當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性S5b被抗體沉淀后，采用常規(guī)二抗進(jìn)行免疫印跡分析時(shí)，在23kD和55kD的位置出現(xiàn)IgG的輕鏈和重鏈條帶(圖2)，信號(hào)寬且彌散，遮蓋了分子質(zhì)量接近輕鏈或重鏈的目的條帶，從而對(duì)S5b的辨識(shí)產(chǎn)生了嚴(yán)重的干擾作用，當(dāng)免疫印跡和免疫沉淀時(shí)所用抗體來(lái)自相同種屬時(shí)尤其明顯。采用TrueBlot抗體作為二抗檢測(cè)可得到清晰的S5b條帶，而不出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈條帶，顯著降低免疫沉淀抗體帶來(lái)的干擾，得到理檢測(cè)效果。2.3S5b及其結(jié)合蛋白的相互作用能夠與S5b免疫共沉淀的Rpt1和Rpt22[3-6]，分子質(zhì)量為49kD[2]，接近重鏈大小，采用TrueBlot二抗檢測(cè)可得到清晰的條帶(圖3)。3討論免疫共沉淀-免疫印跡分析研究蛋白質(zhì)間的相互作用，可以設(shè)計(jì)包含目的蛋白和標(biāo)簽肽的融合基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)，通過(guò)標(biāo)簽肽免疫沉淀目的蛋白并行免疫印跡分析。通常這種方法通過(guò)標(biāo)簽肽的作用可取得很好的檢測(cè)效果，如圖1所示。但由于質(zhì)粒過(guò)表達(dá)生成的蛋白質(zhì)可能驅(qū)動(dòng)非生理性的兩種蛋白質(zhì)間的相互作用[1]，所以一般宜用于分析蛋白質(zhì)間特定的相互作用。采用免疫沉淀/免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用一直以來(lái)是個(gè)難題。比如，分子質(zhì)量接近55kD的蛋白酶體亞基Rpt1，Rpt2[2]，以及分子質(zhì)量接近23kD的多種α和β亞基等[2]，該法效果不佳。免疫復(fù)合物中的免疫沉淀抗體，電泳前在加樣緩沖液所含巰基乙醇和加熱的作用下，還原變性并解離為約55kD的重鏈條帶和23kD的輕鏈條帶，經(jīng)電泳分離并轉(zhuǎn)移至印跡膜上；免疫印跡抗體用于檢測(cè)免疫沉淀物中的興趣蛋白，與印跡膜一起4℃孵育過(guò)夜，保持了非還原的天然結(jié)構(gòu)。免疫印跡中使用的常規(guī)二抗，能結(jié)合?

哂〖７治鍪保??3kD和55kD的位置出現(xiàn)IgG的輕鏈和重鏈條帶(圖2)，信號(hào)寬且彌散，遮蓋了分子質(zhì)量接近輕鏈或重鏈的目的條帶，從而對(duì)S5b的辨識(shí)產(chǎn)生了嚴(yán)重的干擾作用，當(dāng)免疫印跡和免疫沉淀時(shí)所用抗體來(lái)自相同種屬時(shí)尤其明顯。采用TrueBlot抗體作為二抗檢測(cè)可得到清晰的S5b條帶，而不出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈條帶，顯著降低免疫沉淀抗體帶來(lái)的干擾，得到理檢測(cè)效果。2.3S5b及其結(jié)合蛋白的相互作用能夠與S5b免疫共沉淀的Rpt1和Rpt22[3-6]，分子質(zhì)量為49kD[2]，接近重鏈大小，采用TrueBlot二抗檢測(cè)可得到清晰的條帶(圖3)。3討論免疫共沉淀-免疫印跡分析研究蛋白質(zhì)間的相互作用，可以設(shè)計(jì)包含目的蛋白和標(biāo)簽肽的融合基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并表達(dá)，通過(guò)標(biāo)簽肽免疫沉淀目的蛋白并行免疫印跡分析。通常這種方法通過(guò)標(biāo)簽肽的作用可取得很好的檢測(cè)效果，如圖1所示。但由于質(zhì)粒過(guò)表達(dá)生成的蛋白質(zhì)可能驅(qū)動(dòng)非生理性的兩種蛋白質(zhì)間的相互作用[1]，所以一般宜用于分析蛋白質(zhì)間特定的相互作用。采用免疫沉淀/免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用一直以來(lái)是個(gè)難題。比如，分子質(zhì)量接近55kD的蛋白酶體亞基Rpt1，Rpt2[2]，以及分子質(zhì)量接近23kD的多種α和β亞基等[2]，該法效果不佳。免疫復(fù)合物中的免疫沉淀抗體，電泳前在加樣緩沖液所含巰基乙醇和加熱的作用下，還原變性并解離為約55kD的重鏈條帶和23kD的輕鏈條帶，經(jīng)電泳分離并轉(zhuǎn)移至印跡膜上；免疫印跡抗體用于檢測(cè)免疫沉淀物中的興趣蛋白，與印跡膜一起4℃孵育過(guò)夜，保持了非還原的天然結(jié)構(gòu)。免疫印跡中使用的常規(guī)二抗，能結(jié)合天然的免疫印跡抗體顯示待測(cè)蛋白；而免疫沉淀抗體用量通常很大，因此常規(guī)二抗也往往會(huì)與印跡膜上的抗體重鏈和輕鏈結(jié)合，顯示相應(yīng)的條帶，條


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