發(fā)布時間：2021-03-18 14:12

　　探討鼠傷寒沙門氏菌oxyR基因缺失株引起的VBNC狀態(tài)及其與群體感應(yīng)的關(guān)系。運用同源重組的方法構(gòu)建oxyR基因無痕缺失的鼠傷寒沙門氏菌并檢測該菌株對H₂O₂的敏感性;將oxyR基因缺失株和親本株（WT）涂布或滴于LB固體培養(yǎng)基,觀察其是否生長及其濃度依賴性生長情況;用swimming和swarming平板檢測oxyR基因缺失株和WT的運動能力;檢測固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中沙門氏菌分解H₂O₂的能力。成功構(gòu)建了oxyR無痕缺失菌株;oxyR基因缺失株在0.1 mmol/L H₂O₂的LB平板上形成的菌苔發(fā)生了變形,在1 mmol/L H₂O₂的LB平板上不能生長,而WT均能生長;6×10⁶和6×10⁵ cfu/mL的WT涂布于LB平板上能長滿菌苔,而等量的oxyR缺失株不能生長菌落;不同濃度的WT滴于LB平板均能形成菌苔,而oxyR缺失株僅在OD₆₀₀

【文章來源】：微生物學(xué)雜志. 2019,39(01)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

PCＲ擴增Fig．1Theamplificationoffragmentsusedtoconstruct

敏感性oxyＲ是細菌抗氧化作用的關(guān)鍵調(diào)控因子，調(diào)控眾多參與抗氧化作用的基因轉(zhuǎn)錄，包括過氧化氫酶(Kat)的表達。所以oxyＲ基因的缺失將導(dǎo)致細菌對H2O2的敏感性增加，細菌抗氧化作用能力的減弱。因此，將3μLOD600為0．1沙門氏菌WT和oxyＲ基因缺失株菌液滴于含有不同濃度H2O2的LB平板上，觀察其生長情況(圖2)。在0．1mmol/LH2O2的LB平板上，WT生長正常，而oxyＲ基因缺失株的菌苔邊緣由均勻圓潤變?yōu)殇忼X不規(guī)則狀;當(dāng)H2O2達到1mmol/L時，圖2H2O2敏感性實驗Fig．2H2O2sensitiveassayA、B、C分別表示H2O2的濃度為0、0．1、1mmol/LA:0mmol/LH2O2;B:0．1mmol/LH2O2;C:1mmol/LH2O2WT的菌苔由均勻圓潤變?yōu)殇忼X不規(guī)則狀，而oxyＲ基因缺失株已不能生長。實驗結(jié)果表明，oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致其H2O2敏感性增加，抗氧化能力降低，在多種細菌中有類似結(jié)果［24-26］。2．3oxyＲ基因缺失使沙門氏菌進入VBNC狀態(tài)在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)ΔoxyＲ株能在液體培養(yǎng)基中正常生長，而當(dāng)其從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基時，則不能生長。這可能是由于oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致其抗氧化能力減弱，從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基時，在新的氧化壓力下，細菌進入了VBNC狀態(tài)。因此，將6×106和6×105cfu/mL涂布于LB平板上培養(yǎng)。由圖3可知，WT在LB平板上生長正常，由于活菌數(shù)高，整個平板長滿了菌苔;而oxyＲ缺失株在LB平板上沒有菌落生成。結(jié)果表明，oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致沙門氏菌進入了VBNC狀態(tài)。圖3WT和oxyＲ株在平板生長情況Fig．3ThegrowthofWTandoxyＲmutan

狀態(tài)在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)ΔoxyＲ株能在液體培養(yǎng)基中正常生長，而當(dāng)其從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基時，則不能生長。這可能是由于oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致其抗氧化能力減弱，從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基時，在新的氧化壓力下，細菌進入了VBNC狀態(tài)。因此，將6×106和6×105cfu/mL涂布于LB平板上培養(yǎng)。由圖3可知，WT在LB平板上生長正常，由于活菌數(shù)高，整個平板長滿了菌苔;而oxyＲ缺失株在LB平板上沒有菌落生成。結(jié)果表明，oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致沙門氏菌進入了VBNC狀態(tài)。圖3WT和oxyＲ株在平板生長情況Fig．3ThegrowthofWTandoxyＲmutantstrainonLBplatesA:接種6×106cfu/mL，WT株;B:接種6×105cfu/mL，WT株;C:接種6×106cfu/mL，ΔoxyＲ株;D:接種6×105cfu/mL，ΔoxyＲ株A:6×106cfu/mL，WT;B:6×105cfu/mL，WT;C:6×106cfu/mL，ΔoxyＲ;D:6×105cfu/mL，ΔoxyＲ2．4沙門氏菌群體感應(yīng)能復(fù)蘇VBNC狀態(tài)雖然oxyＲ基因的缺失導(dǎo)致沙門氏菌進入了VBNC狀態(tài)，但是我們也發(fā)現(xiàn)ΔoxyＲ株能從固體培養(yǎng)基上取種劃線培養(yǎng)于新鮮LB平板，所以我們猜想當(dāng)ΔoxyＲ株細菌濃度達到一定時，VBNC狀態(tài)能夠復(fù)蘇。因此，制備OD600為100、10－1、10－2、10－3、10－4和10－5的WT和ΔoxyＲ株菌液，各取3μL，直接滴于LB平板。生長結(jié)果如圖4所示，WT在所有濃度下均能生長為菌苔，而oxyＲ基因缺失株僅在濃度極高，即OD600為100和10－11期廖何斌等:鼠傷寒沙門氏菌群體感應(yīng)復(fù)蘇oxyＲ基因缺失引起的VBNC狀態(tài)37

【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌抗氧化系統(tǒng)-oxyR調(diào)節(jié)子研究進展[J]. 汪保衛(wèi),施慶珊,歐陽友生,陳儀本.  微生物學(xué)報. 2008(11)



本文編號：3088462