肝臟是人體內(nèi)綜合性的“生物化學(xué)工廠”，承擔(dān)多種生理功能。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是一切生命活動的基礎(chǔ)，研究肝臟蛋白質(zhì)在相互作用中形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)是全面認(rèn)識肝臟生理功能、理解其分子調(diào)控機理的重要手段。細(xì)胞生長因子在肝臟生長發(fā)育、損傷和修復(fù)及功能調(diào)控中起關(guān)鍵作用。與肝臟相關(guān)的生長因子包括HGF、EGF、insulin、TGFs等，激活MAPK、PI3K/Akt、SMAD等多條主要信號途徑，引起肝細(xì)胞增殖、存活、細(xì)胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)發(fā)生等多種生物學(xué)效應(yīng)。開展肝臟相關(guān)生長因子信號途徑蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究，是中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃（CNHLPP）之蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖研究專題的重要組成部分。蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸激酶Akt調(diào)控包括細(xì)胞存活、增殖、生長、凋亡和糖原代謝在內(nèi)的多種生物學(xué)事件，在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷移和葡萄糖代謝等過程中充當(dāng)著關(guān)鍵角色。本課題以PI3K/Akt通路重要分子為誘餌，采用酵母雙雜交方法篩選人肝臟cDNA文庫，從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的角度，對肝臟相關(guān)生長因子信號途徑的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行初步研究。本文成功構(gòu)建了31個誘餌載體，包括PI3K/Akt通路的關(guān)鍵節(jié)點、激酶、負(fù)調(diào)控分子和... 

【文章來源】：中國人民解放軍軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

PI3玲A旅信號通路

2.1.2文庫代表性及其插入片段大小從滴度測定平板上隨機挑取23個克隆，以pPC86多克隆位點兩端序列為引物進行菌落PCR擴增文庫的插入片段，PCR擴增結(jié)果如圖2.3。圖2.3文庫菌落插入片段PCR結(jié)果。泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DLZooo，其余泳道為文庫菌落插入片段PCR產(chǎn)物。引自劉瓊明博士論文。從上圖可以看出，23個隨機挑取的克隆中21個克隆有明顯擴增;插入片段大都在1.Okb以上，少數(shù)(4/23)克隆插入片段大于2.Okb，平均大小在1.skb一2.Okb之間。2.1.3文庫擴增不論是文庫的滴度、文庫的代表性還是文庫的平均插入片段大小，都與文庫說明書基本相符，滿足YZH篩庫的需求，我們隨即對文庫進行了擴增:100川文庫稀釋后涂布在360塊150~LB/Amp平板上

需要檢測誘餌(pDBLeu一X)的自激活情況。將pDBL￡u一X和AD空載體(pPC86)共轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞MaV203，將長出的克隆復(fù)制到3AT濃度分別為25、50、75、100~o譏的SC一Leu~T印一His平板上進行自激活檢測(圖2.4)。如果MaVZ仍(pDBLeu一x+PPC86)在100~oUL的平板上還能生長，則誘餌自身自激活活性太強。對于在低于100們 nrnol/L3AI，平板上不能生長的克隆，抑制其生長的3AT濃度即為相應(yīng)誘餌篩選文庫時選擇性平板所需的3AT濃度(表2.4)。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]大規(guī)模酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用[J]. 吳志豪,王建,賀福初.  遺傳. 2006(12)

博士論文
[1]人類肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化還原調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步研究[D]. 劉瓊明.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2006



本文編號：3068340