本文關(guān)鍵詞：人巨細(xì)胞病毒pUL38激活mTORC1的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人巨細(xì)胞病毒是β型皰疹病毒家族中的成員,能感染多種不同的細(xì)胞類型。人巨細(xì)胞病毒的感染是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要原因之一,此外它能在免疫缺陷的人中引起嚴(yán)重的疾病。這種病毒一旦感染了宿主之后,就不能被宿主的免疫系統(tǒng)徹底清除,之后它將以一種潛伏感染的形式終生存在,并且在宿主體內(nèi)反復(fù)感染發(fā)作。作為細(xì)胞專噬性病毒,人巨細(xì)胞病毒已經(jīng)進(jìn)化出了多種機(jī)制在宿主細(xì)胞內(nèi)創(chuàng)造一種有利于自身生存和復(fù)制的環(huán)境。由于m TORC1在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白合成及同化代謝等方面都起著非常重要的作用,因此它常常成為病毒調(diào)控的作用靶標(biāo)。許多病毒都已進(jìn)化出了多種多樣的機(jī)制或通過直接作用于m TORC1或間接作用于m TORC1的上下游分子來激活細(xì)胞內(nèi)m TORC1這條重要的信號通路。盡管人巨細(xì)胞病毒在感染之后會引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的壓力,但是它依然能維持高活性的m TORC1水平。已有研究報道人巨細(xì)胞病毒中的多功能蛋白p UL38能通過結(jié)合并拮抗TSC2來激活m TORC1,p UL38也能抑制在巨細(xì)胞病毒感染過程中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究中我們揭示了p UL38的N端截短突變體p UL3825-331在抑制細(xì)胞凋亡方面具有完整的功能。然而有趣的是p UL3825-331雖然失去了結(jié)合TSC2的能力但它卻依然能夠激活m TORC1,盡管和全長的p UL38相比稍微弱了一點(diǎn)。表達(dá)p HA-UL3825-331的重組病毒產(chǎn)生病毒的能力和野生型病毒相比大約降低了10倍,這表明p UL38和TSC2的相互作用在產(chǎn)生有效病毒方面的重要性。通過利用點(diǎn)突變分析的方法我們確認(rèn)了p UL38中位于第23和24位的氨基酸基序TQ對于其和TSC2的相互作用是極其重要的。更重要的是,當(dāng)過表達(dá)突變體p HA-UL38 TQ/AA時,它能夠像p HA-UL3825-331一樣激活m TORC1。通過利用CRISPR基因編輯技術(shù)我們構(gòu)建了TSC2敲除的U373-MG單克隆細(xì)胞系,并且揭示了p UL38在TSC2敲除的細(xì)胞中能夠更進(jìn)一步地激活m TORC1。因此本研究確定了p UL38中對p UL38和TSC2相互作用來說所重要的TQ氨基酸基序,并且闡明了p UL38能通過TSC2依賴和不依賴2種方式激活m TORC1。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 p UL38 m TORC1 TSC2
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.11
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-15
• 第一節(jié) 人巨細(xì)胞病毒簡介9-11
• 1.1 人巨細(xì)胞病毒的結(jié)構(gòu)及基因組9-10
• 1.2 人巨細(xì)胞病毒的致病性10-11
• 1.3 人巨細(xì)胞病毒的傳播11
• 第二節(jié)HCMV病毒蛋白PUL3811-15
• 第二章15-44
• 第一節(jié) 研究背景15-17
• 第二節(jié) 研究目的和方法17
• 第三節(jié) 實驗材料17-20
• 3.1 載體和重組質(zhì)粒17-18
• 3.2 實驗試劑和抗體18
• 3.3 主要實驗儀器與耗材18-19
• 3.4 實驗用細(xì)胞和病毒19-20
• 第四節(jié) 實驗方法20-25
• 4.1 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇20-21
• 4.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)21
• 4.3 細(xì)胞計數(shù)21
• 4.4 HCMV病毒擴(kuò)增21-22
• 4.5 病毒滴定（TCID50）22-23
• 4.6 病毒生長曲線23
• 4.7 蛋白免疫印跡法23-24
• 4.8 免疫共沉淀24-25
• 4.9 HF細(xì)胞中shRNR敲低TSC225
• 4.10 構(gòu)建TSC2 敲除的U373-MG單克隆細(xì)胞25
• 第五節(jié) 實驗結(jié)果分析25-40
• 5.1 表達(dá)pUL38 一系列N端截短體的HCMV病毒的構(gòu)建和分析25-29
• 5.2 在HCMV病毒感染過程中，，pUL3825-331 蛋白在不結(jié)合TSC2 的情況下依然能激活mTORC129-32
• 5.3 單獨(dú)過表達(dá)pUL3825-331 時，它能以一種不依賴于TSC2 的方式激活mTORC132-33
• 5.4 氨基酸基序TQ對于PUL38 與TSC2 之間的相互作用是必要的33-35
• 5.5 點(diǎn)突變體pUL38 TQ/AA和pUL38 E/A表現(xiàn)出與突變體pUL3825-331 相同的功能35-38
• 5.6 在TSC2 敲除的細(xì)胞中pUL38 能更進(jìn)一步地激活mTORC138-40
• 第六節(jié) 討論40-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章51-52
• 致謝52-53

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