本文關(guān)鍵詞：結(jié)核潛伏抗原篩選與治療性融合蛋白疫苗的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:將潛伏期細(xì)菌表達(dá)的優(yōu)勢(shì)抗原與生長(zhǎng)期細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)抗原結(jié)合,有助于開(kāi)發(fā)保護(hù)效果更好的新型結(jié)核亞單位疫苗。本試驗(yàn)擬篩選免疫原性較強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌潛伏期抗原,制備含結(jié)核菌潛伏期抗原的新型治療性融合蛋白疫苗。進(jìn)一步建立小鼠肺部卡介苗(BCG)潛伏感染模型,并用該模型對(duì)新構(gòu)建的融合蛋白疫苗的治療作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。方法:1)在大腸埃希菌中克隆表達(dá)前期利用生物信息學(xué)方法篩選出的HspX、Rv1738、Rv2626c、Rv2007c和Rv3130c五個(gè)與結(jié)核潛伏感染相關(guān)抗原,檢測(cè)它們?cè)诮Y(jié)核病患者、密切接觸者和健康大學(xué)生志愿者中體液免疫和細(xì)胞免疫特征,評(píng)價(jià)上述抗原的免疫原性,篩選出免疫原性最強(qiáng)的抗原。2)通過(guò)基因工程技術(shù),構(gòu)建融合蛋白pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c(LT40)和pET30a-CFP10-HspX(LT28),然后在大腸埃希菌中表達(dá)、得到相應(yīng)的蛋白。3)在小鼠模型上檢測(cè)融合蛋白LT40的免疫原性,即在第0、3、6周分別用蛋白LT40、ESAT6、Rv1738和Rv2626c免疫小鼠三次,末次免疫后6周檢測(cè)小鼠結(jié)核抗原的特異性抗體水平及脾細(xì)胞在結(jié)核抗原刺激下細(xì)胞因子IFN-γ的分泌情況。4)用牛分枝桿菌減毒株卡介苗(BCG)5×106CFU通過(guò)滴鼻的方法造成小鼠肺部感染,感染后2天、4周、8周和12周行肺部結(jié)核菌落計(jì)數(shù),并肌肉注射地塞米松以降低小鼠的免疫力,連續(xù)干預(yù)3周后隔一周進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。地塞米松干預(yù)后檢測(cè)小鼠肺部BCG的細(xì)菌載量,來(lái)確定潛伏感染模型是否建成。即當(dāng)小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌,但經(jīng)地塞米松免疫干預(yù)后,從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌時(shí),該模型成功建成。5)利用建立的小鼠肺部BCG潛伏感染模型來(lái)評(píng)價(jià)融合蛋白疫苗的治療作用,使用的融合蛋白包括:ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)和LT40,我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)LT70對(duì)感染結(jié)核菌的小鼠具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。小鼠感染BCG后隨機(jī)分為五組:PBS組、佐劑組、LT40組、LT70組和LT40+LT70組。疫苗組小鼠分別于第12、14和16周用腹股溝皮下注射的方法進(jìn)行疫苗治療干預(yù),生理鹽水組和佐劑組小鼠同樣注射生理鹽水和佐劑作為對(duì)照。所有小鼠分別于第20、21和22周用肌肉注射地塞米松的方法進(jìn)行免疫干預(yù),在第25周用頸椎脫臼的方法處死小鼠,進(jìn)行肺臟組織的分離與解剖和眼球取血,將肺臟組織研磨后進(jìn)行bcg菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果:1.人群試驗(yàn)結(jié)果表明,在5個(gè)結(jié)核菌潛伏期高表達(dá)的抗原h(huán)spx、rv2626c、rv2007c、rv1738和rv3130c中,在不同人群中抗原的免疫原性強(qiáng)弱依次是rv1738、rv2626c、rv3130c、hspx和rv2007c。這些抗原的免疫原性在結(jié)核病密切接觸者中均高于健康大學(xué)生志愿者和結(jié)核病患者。相反,在結(jié)核病患者人群中,結(jié)核生長(zhǎng)早期分泌性抗原esat6和cfp10引起ifn-γ的分泌水平卻高于健康大學(xué)生志愿者。我們推測(cè)抗原rv1738、rv2626c、rv3130c在保護(hù)機(jī)體免受結(jié)核分枝桿菌侵害過(guò)程中起了不同程度的保護(hù)作用,其中在潛伏感染人群中,rv1738抗原引起的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強(qiáng),是結(jié)核菌潛伏期的一個(gè)保護(hù)性抗原。2.串聯(lián)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)期抗原esat6、潛伏期抗原rv1738和rv2626c構(gòu)建融合蛋白疫苗lt40,發(fā)現(xiàn)其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達(dá),得到較高純度的蛋白;連接結(jié)核桿菌生長(zhǎng)期抗原cfp10和潛伏期抗原h(huán)spx構(gòu)建的融合蛋白lt28在大腸埃希菌中表達(dá)量低,未純化出相應(yīng)蛋白。3.小鼠免疫實(shí)驗(yàn)表明:lt40蛋白可誘導(dǎo)lt40抗原免疫過(guò)的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體igg1和igg2c,可刺激lt40抗原免疫過(guò)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌較高水平的ifn-γ,而單個(gè)抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱,提示融合蛋白lt40誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與天然抗原有所不同。4.成功建立小鼠肺部bcg潛伏感染模型。以滴鼻的方式使小鼠肺部感染bcg,12周后小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌,但經(jīng)地塞米松免疫干預(yù)后分枝桿菌大量暴發(fā),從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌。5.利用建立的小鼠肺部bcg潛伏感染模型來(lái)評(píng)價(jià)蛋白疫苗的治療作用,結(jié)果示:相比其他組,pbs組結(jié)核菌載量較高,說(shuō)明有大量的分枝桿菌在免疫抑制后暴發(fā);相比pbs組,疫苗治療組和佐劑組的結(jié)核菌載量均較低,而疫苗治療組(lt40組、lt70組和lt40+lt70組)的結(jié)核菌載量最低。說(shuō)明lt40蛋白和lt70蛋白對(duì)小鼠肺部潛伏感染的bcg有一定的清除作用。結(jié)論:1.在與結(jié)核潛伏感染相關(guān)的抗原(hspx、rv2626c、rv2007c、rv1738和rv3130c)中,rv1738抗原引起的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強(qiáng),是結(jié)核菌潛伏期的一個(gè)保護(hù)性抗原。6.成功構(gòu)建融合蛋白疫苗lt40,其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達(dá),得到較高純度的蛋白;LT40蛋白可誘導(dǎo)LT40抗原免疫過(guò)的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體IgG1和IgG2c,可刺激LT40抗原免疫過(guò)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌較高水平的IFN-γ,而單個(gè)抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱,提示融合蛋白LT40誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與天然抗原有所不同。2.成功建立小鼠肺部BCG潛伏感染模型,為結(jié)核蛋白疫苗的治療效果評(píng)價(jià)提供了一個(gè)簡(jiǎn)單易行的模型。3.融合蛋白LT40和LT70對(duì)小鼠肺部潛伏感染的BCG有一定的清除作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 潛伏感染 融合蛋白疫苗 治療性疫苗 Rv1738 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-9
• 縮略詞9-13
• 前言13-16
• 1 結(jié)核病的現(xiàn)狀13
• 2 結(jié)核疫苗的研究概況13-14
• 3 抗原篩選的重要性14
• 4 治療性疫苗的研究進(jìn)展14-16
• 實(shí)驗(yàn)一、結(jié)核潛伏抗原的篩選16-41
• 1.1 主要材料16
• 1.2 主要儀器設(shè)備16-17
• 1.3 受試人群17
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法17-28
• 1.4.1 應(yīng)用生物信息學(xué)篩選抗原17
• 1.4.2 單個(gè)蛋白R(shí)v1738和Rv2007c的構(gòu)建17-21
• 1.4.3 單個(gè)蛋白R(shí)v1738、Rv2007c、Rv2626c、HspX、ESAT6、CFP10和Rv3130c的表達(dá)21-22
• 1.4.4 單個(gè)蛋白R(shí)v1738、Rv2007c、Rv2626c、HspX、ESAT6、CFP10和Rv3130c的純化22-24
• 1.4.5 SDS-PAGE蛋白電泳相關(guān)試劑配制及方法24-26
• 1.4.6 Bradford法測(cè)定蛋白濃度26
• 1.4.7 ELISPOT技術(shù)檢測(cè)人群細(xì)胞因子IFN-γ 的分泌水平26-27
• 1.4.8 ELISA方法檢測(cè)人群體液免疫應(yīng)答27-28
• 1.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-40
• 1.5.1 抗原篩選28-29
• 1.5.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定29-33
• 1.5.3 單個(gè)蛋白的表達(dá)33-34
• 1.5.4 單個(gè)蛋白的純化34-35
• 1.5.5 單個(gè)蛋白的濃度檢測(cè)35-36
• 1.5.6 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌IFN-γ 的水平36-40
• 1.6 實(shí)驗(yàn)小結(jié)40-41
• 實(shí)驗(yàn)二、融合蛋白疫苗LT28和LT40的構(gòu)建41-56
• 2.1 主要材料41
• 2.2 主要儀器設(shè)備41-42
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 2.3.1 重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c (+)(LT40)的構(gòu)建42-44
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pET30a-CFP10-HspX (+)(LT28)的構(gòu)建44-46
• 2.3.3 重組質(zhì)粒LT40和LT28的蛋白表達(dá)及純化46-47
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 2.4.1 重組質(zhì)粒pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c (+)(LT40)的構(gòu)建47-48
• 2.4.2 重組質(zhì)粒pET30a-CFP10-HspX (LT28)的構(gòu)建48-50
• 2.4.3 重組質(zhì)粒LT40和LT28的測(cè)序驗(yàn)證50-54
• 2.4.4 重組質(zhì)粒LT40和LT28的蛋白表達(dá)及純化54-55
• 2.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)55-56
• 實(shí)驗(yàn)三、融合蛋白LT40的免疫原性檢測(cè)56-65
• 3.1 主要材料56
• 3.2 主要儀器設(shè)備56
• 3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56-57
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法57-59
• 3.4.1 疫苗免疫小鼠程序57
• 3.4.2 ELISPOT方法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的情況57-58
• 3.4.3 ELISA技術(shù)檢測(cè)小鼠血清抗體滴度58-59
• 3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-64
• 3.5.1 結(jié)核亞單位疫苗LT40的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)結(jié)果59-60
• 3.5.2 結(jié)核亞單位疫苗LT40的體液免疫檢測(cè)結(jié)果60-64
• 3.6 實(shí)驗(yàn)小結(jié)64-65
• 實(shí)驗(yàn)四、小鼠肺部BCG潛伏感染模型的建立及蛋白疫苗的治療作用評(píng)價(jià)65-70
• 4.1 主要材料65
• 4.2 主要儀器設(shè)備65-66
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法66-68
• 4.3.1 小鼠解剖實(shí)驗(yàn)流程66
• 4.3.2 肺部菌落計(jì)數(shù)66-67
• 4.3.3 疫苗與佐劑的制備67
• 4.3.4 實(shí)驗(yàn)流程67-68
• 4.3.5 實(shí)驗(yàn)分組68
• 4.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法68
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-70
• 4.4.1 小鼠肺部BCG潛伏感染模型的建立68-69
• 4.4.2 用此模型來(lái)評(píng)價(jià)蛋白疫苗的治療性作用69-70
• 4.5 實(shí)驗(yàn)小結(jié)70
• 討論70-74
• 1 抗原篩選70-71
• 2 融合蛋白的構(gòu)建71-72
• 3 疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型72
• 4 治療性疫苗72-74
• 結(jié)論74-75
• 參考文獻(xiàn)75-79
• 在學(xué)期間的研究成果與參與課題79-80
• 致謝80

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