本文關(guān)鍵詞：重組胱抑素C的表達及免疫活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:1.表達和純化重組的人胱抑素C(cystatin C,Cys C)蛋白;2.鑒定純化的重組Cys C蛋白;3.重組Cys C蛋白的免疫活性的檢測。方法:1.根據(jù)Gen Bank中人Cys C功能區(qū)的氨基酸序列,選擇大腸埃希菌喜好的編碼密碼子設(shè)計合成編碼基因序列,利用PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))獲取目的片段,在原核系統(tǒng)中表達重組人胱抑素C蛋白。2.純化表達的Cys C重組蛋白,用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(間接ELISA法)測定其反應(yīng)靈敏度及免疫活性。結(jié)果:1.PCR擴增Cys C后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在250~500bp位置處發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰的、大小約為450bp的DNA條帶,相對分子質(zhì)量大小與Cys C基因大小相符,因此可初步確定為目的條帶。構(gòu)建的重組載體p MD18-T-Cys C,經(jīng)Bam H I和Xho I雙酶切鑒定后可見兩條條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,經(jīng)過上海生工公司測序,證明為Cys C編碼序列;2.將連接表達載體的連接物誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的菌株表達了一個大小約為35k D的蛋白,而在對照組中沒有出現(xiàn)這一條帶,初步說明重組基因在大腸桿菌中獲得了有效表達;3.Western Blotting結(jié)果顯示,表達的重組蛋白與抗Cys C多克隆抗體在大小約為35k D處發(fā)生了反應(yīng),而陰性對照則沒有此條帶的出現(xiàn),進一步說明了重組蛋白為Cys C蛋白,并且具有良好的免疫反應(yīng)活性;4.間接ELISA結(jié)果顯示,在包被濃度為0.5mg/L時便產(chǎn)生了陽性值(一般以陰性值的2.1倍設(shè)為臨界值),表明該重組蛋白具有極高的反應(yīng)靈敏度。結(jié)論:1.成功建立了Cys C原核表達系統(tǒng);2.Cys C重組蛋白具有良好的反應(yīng)靈敏度;3.Cys C重組蛋白免疫小鼠后血清中Ig G效價已達制備單克隆抗體的要求,為Cys C單克隆抗體的制備打下夯實的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CysC 原核表達 反應(yīng)靈敏度 免疫活性分析
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 1. 引言11-13
• 2. 試劑和方法13-27
• 2.1 儀器與試劑13-19
• 2.1.1 主要儀器13-14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 常用溶液和培養(yǎng)基配方15-19
• 2.2 實驗方法19-20
• 2.2.1 CysC目的片段的優(yōu)化合成和引物探針設(shè)計與合成19
• 2.2.2 PCR擴增CysC的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件19
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳及回收19-20
• 2.2.4 E.coli Top10F’感受態(tài)細胞的制備20
• 2.3 CysC克隆載體的構(gòu)建20-22
• 2.3.1 目的片段和pMD18-T載體連接20-21
• 2.3.2 連接物的轉(zhuǎn)化21
• 2.3.3 重組克隆質(zhì)粒的提取及測序21-22
• 2.3.4 重組克隆質(zhì)粒的酶切鑒定及凝膠電泳22
• 2.4. CysC表達載體的構(gòu)建22-23
• 2.4.1 回收的基因片段和表達載體pET-32a的連接22-23
• 2.4.2 感受態(tài)表達菌株ER2566的制備23
• 2.5 CysC目的蛋白的表達和鑒定23-27
• 2.5.1 CysC目的蛋白的小量誘導(dǎo)表達23-24
• 2.5.2 CysC目的蛋白活性鑒定24
• 2.5.3 重組Cys C蛋白的純化與鑒定24-25
• 2.5.4 間接ELISA檢測重組蛋白的抗原反應(yīng)性25-26
• 2.5.5 間接ELISA檢測重組蛋白的免疫原性26-27
• 3. 結(jié)果27-33
• 3.1 CysC基因擴增產(chǎn)物的鑒定27
• 3.2 重組CysC克隆質(zhì)粒的鑒定27-28
• 3.3 重組CysC表達質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定28
• 3.4 CysC重組蛋白的誘導(dǎo)表達28-29
• 3.5 CysC重組蛋白表達方式鑒定及純化29-30
• 3.6 CysC重組蛋白的免疫反應(yīng)性鑒定30-31
• 3.7 間接ELISA檢測CysC重組蛋白反應(yīng)靈敏度31
• 3.8 間接ELISA檢測CysC重組蛋白免疫原性31-33
• 4. 討論33-36
• 5. 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-40
• 綜述40-57
• 參考文獻47-57
• 讀研期間發(fā)表的論文57
• 讀研期間參與的課題57-58
• 縮略詞對照表58-59
• 致謝59-60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊霄鵬;呂同德;劉斌;王曉輝;唐瑜;賈慶華;;重組人脂聯(lián)素融合蛋白在大腸埃希菌BL21中的表達[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年01期

2 向禮賢;血清胱抑素C檢測與疾病[J];四川醫(yī)學(xué);2004年11期

  本文關(guān)鍵詞：重組胱抑素C的表達及免疫活性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302495