目的　利用巴斯德畢赤 （Pichia pastoris）酵母真核表達(dá)系統(tǒng) ,構(gòu)建真核表達(dá)載體 p PIC9K與人溶菌酶基因 （humanlysozyme,h L Y）的重組質(zhì)粒 p PIC9K- h L Y,表達(dá)出具有活性的人溶菌酶 .方法　此項(xiàng)研究在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人溶菌酶（h L Y）基因與 p UC19的重組質(zhì)粒 p UC19- h L Y的基礎(chǔ)上 ,通過設(shè)計(jì)一對引物 ,用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）擴(kuò)增出人溶菌酶全基因片段后 ,將其克隆到巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體p PIC9K中 ,構(gòu)建重組質(zhì)粒 p PIC9K- h L Y,經(jīng) Bg1 酶切線性化后 ,用電穿孔法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞內(nèi) .通過 G418篩選 ,選到的高拷貝轉(zhuǎn)化子經(jīng) PCR檢測人溶菌基因與畢赤酵母染色體是否穩(wěn)定整合 ,陽性克隆經(jīng)甲醇誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá) .結(jié)果　序列測定 ,經(jīng) PCR擴(kuò)增后的人溶菌酶基因與文獻(xiàn)發(fā)表的序列相比 ,缺失 4個(gè)堿基 .我們決定采用重組 PCR法予以糾正 ,經(jīng)序列測定結(jié)果正確 .用 PCR檢測 ,人溶菌酶基因與畢赤酵母染色體穩(wěn)定整合 .用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并以 SDS- PAGE分析 ,在 Mr為 15 ... 

【文章來源】：第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2001,(22)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
0 引言
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 重組質(zhì)粒pPIC9K-hLY的構(gòu)建
        1.2.2 轉(zhuǎn)染畢赤酵母菌
        1.2.3 PCR檢測hLY基因與畢赤酵母染色體基因組的整合
        1.2.4 人溶菌酶基因的表達(dá)和鑒定
2 結(jié)果
    2.1 PCR擴(kuò)增hLY基因及重組質(zhì)粒pPIC9K-hLY的酶切鑒定
    2.2 PCR分析hLY基因與畢赤酵母菌 （SMD1168） 染色體基因組的整合
    2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
        2.3.1 SDS-PAGE測定
        2.3.2 抗原性測定
        2.3.3 活性測定
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：2995638