目的:構(gòu)建能高效表達成熟miR-508-5p小分子的慢病毒過表達載體,研究其對MAPK1/ERK信號通路靶向調(diào)控作用。方法:利用化學(xué)合成miR-508-5p莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA,并將其克隆入線性化的pSicoR質(zhì)粒中,經(jīng)雙酶切及測序鑒定;同時構(gòu)建與miR-508-5p互補靶基因MAPK1的3’非翻譯區(qū),將其克隆入線性化的Report載體中。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將鑒定陽性的pSicoR-miR-508-5p重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,進一步通過Relative luciferase activity、Western blot及real-time PCR試驗檢測MAPK1蛋白和mRNA相對表達水平。結(jié)果:酶切及測序結(jié)果證明成功構(gòu)建pSicoR-miR-508-5p及Report-MAPK1 3’-UTR重組質(zhì)粒,并通過實驗證實miR-508-5p過表達明顯抑制MAPK1的蛋白表達水平及mRNA相對含量（P<0.05）;抑制miR-508-5p的表達,又明顯上調(diào)MAPK1的蛋白表達水平及mRNA相對含量（P<0.05）。結(jié)論:成功構(gòu)建pSicoR-miR-508-5p慢病毒過表達載... 

【文章來源】：中國免疫學(xué)雜志. 2014,30(01)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

pSicoＲ-miＲ-508-5p和預(yù)測靶基因Ｒeport-MAPK13'-UTＲ雙酶切圖

圖2pSicoＲ-miＲ-508-5p過表達載體測序結(jié)果Fig．2SequencingresultsofpSicoＲ-miＲ-508-5poverexpressionvector圖3Ｒeport-MAPK13'-UTＲ重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig．3Sequencingresultsofreport-MAPK13'-UTＲplasmid圖4雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miＲ-508-5p與MAPK1靶向抑制作用，共轉(zhuǎn)染海蜃熒光素酶做內(nèi)對照Fig．4TovarifythetargetedinhibitionbetweenmiＲ-508-5pandMAPK1withluciferasereportersystem，co-transfectionluciferaseofseamirageasaninternalcontrolNote:*．P＜0．05．2．3雙熒光素酶報告系統(tǒng)hsa-miＲ-508-5p過表達載體組明顯抑制MAPK1的熒光素酶活性，與正常對照組相比下降約6倍(P＜0．05);而轉(zhuǎn)染了hsa-miＲ-508-5pinhibitor組，MAPK1的熒光素酶活性又明顯升高約1．5倍(P＜0．05)。hsa-miＲ-508-5p對mut-MAPK1沒有作用。證實hsa-miＲ-508-5p能靶向作用于MAPK13'-UTＲ互補位點，抑制其表達，而敲除其作用位點，不具有靶向關(guān)系(圖4A)。同時列出了MAPK1熒光素酶相對活性及miＲ-508-5p與MAPK1靶向位點預(yù)測(圖4B)。2．4重組過表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T利用脂質(zhì)體將鑒定的陽性重組pSicoＲ-miＲ-508-5p表達載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，相差顯微鏡下觀察GFP熒光表達情況(圖5)。2．5Westernblot通過Westernblot法檢測MAPK1蛋白的表達水平，證實感染pSicoＲ-miＲ-508-5p重組慢病毒的293T細(xì)胞中MAPK1蛋白表達量較正常293T細(xì)胞中明顯降低，而轉(zhuǎn)染了miＲ-508inhibitor組MAPK1蛋白表達水平又明顯升高(圖6)，說明pSicoＲ-miＲ-508-5p直接靶標(biāo)MAPK1白靜等miＲ-508-5p慢病毒過表達載體構(gòu)建及對MAPK1/EＲK信號通路靶向抑制作用的研究第1期·37·

圖2pSicoＲ-miＲ-508-5p過表達載體測序結(jié)果Fig．2SequencingresultsofpSicoＲ-miＲ-508-5poverexpressionvector圖3Ｒeport-MAPK13'-UTＲ重組質(zhì)粒測序結(jié)果Fig．3Sequencingresultsofreport-MAPK13'-UTＲplasmid圖4雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miＲ-508-5p與MAPK1靶向抑制作用，共轉(zhuǎn)染海蜃熒光素酶做內(nèi)對照Fig．4TovarifythetargetedinhibitionbetweenmiＲ-508-5pandMAPK1withluciferasereportersystem，co-transfectionluciferaseofseamirageasaninternalcontrolNote:*．P＜0．05．2．3雙熒光素酶報告系統(tǒng)hsa-miＲ-508-5p過表達載體組明顯抑制MAPK1的熒光素酶活性，與正常對照組相比下降約6倍(P＜0．05);而轉(zhuǎn)染了hsa-miＲ-508-5pinhibitor組，MAPK1的熒光素酶活性又明顯升高約1．5倍(P＜0．05)。hsa-miＲ-508-5p對mut-MAPK1沒有作用。證實hsa-miＲ-508-5p能靶向作用于MAPK13'-UTＲ互補位點，抑制其表達，而敲除其作用位點，不具有靶向關(guān)系(圖4A)。同時列出了MAPK1熒光素酶相對活性及miＲ-508-5p與MAPK1靶向位點預(yù)測(圖4B)。2．4重組過表達載體轉(zhuǎn)染HEK-293T利用脂質(zhì)體將鑒定的陽性重組pSicoＲ-miＲ-508-5p表達載體轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞，相差顯微鏡下觀察GFP熒光表達情況(圖5)。2．5Westernblot通過Westernblot法檢測MAPK1蛋白的表達水平，證實感染pSicoＲ-miＲ-508-5p重組慢病毒的293T細(xì)胞中MAPK1蛋白表達量較正常293T細(xì)胞中明顯降低，而轉(zhuǎn)染了miＲ-508inhibitor組MAPK1蛋白表達水平又明顯升高(圖6)，說明pSicoＲ-miＲ-508-5p直接靶標(biāo)MAPK1白靜等miＲ-508-5p慢病毒過表達載體構(gòu)建及對MAPK1/EＲK信號通路靶向抑制作用的研究第1期·37·


本文編號：2993110