目的:免疫熒光染色（ImmunofluorescenceStaining, IF）是進行視網(wǎng)膜研究的重要方法之一。為了獲得最優(yōu)的IF結(jié)果,我們對視網(wǎng)膜的固定方法進行優(yōu)化。方法:以小鼠視網(wǎng)膜為觀察對象,分別采用浸泡固定方法（Immersion, I）、灌注法（Perfusion, P）以及兩者聯(lián)合（I+P）的方法進行固定,以IF方法對Pax6和Rhodopsin等抗原進行染色,對比各組視網(wǎng)膜組織的IF染色效果。其中,具體分組包括:浸泡固定2小時組（I2）,浸泡固定12小時組（I12）,浸泡固定24小時組（I24）,灌注組（P）,灌注+浸泡后固定2小時組（P+I2）,灌注+浸泡后固定12小時組（P+I12）。結(jié)果:從大體結(jié)構(gòu)來看,P+I2組的固定良好率達100%,I12、I24、P+I12組的良好率達83.33%,I2組和P組較低,分別是16.67%和0%。從Pax6的IF染色來看,I12組的染色滿意度達100%,P+I2組和P+I12組的滿意度為83.33%,I2組、I24組和P組的滿意度較低,為16.67%。從Rhodopsin的IF染色結(jié)果來看,P+I2組和P+I12組的染色滿意度為... 

【文章來源】：現(xiàn)代生物醫(yī)學進展. 2019,19(11)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

種不同后固定方法處理后小鼠視網(wǎng)膜的Hoechst染色結(jié)果

現(xiàn)代生物醫(yī)學進展biomed.cnjournals.comProgressinModernBiomedicineVol.19NO.11JUN.2019GroupsAmount(n)RateofSatisfactoryStainingRateofDissatisfactoryStainingI2Group616.6783.33I12Group61000I24Group616.6783.33PGroup616.6783.33P+I2Group683.3316.67P+I12Group683.3316.67圖26種不同后固定方法處理后小鼠視網(wǎng)膜的Pax6免疫熒光染色結(jié)果Fig.2IFstainingofPax6onmouseretinaethatwerefixedbysixdifferentmethodsNote:SectionsofallgroupsshowedpositivestainingintheGanglioncelllayer(GCL)andInnernuclearlayer(INL).TheratesofsatisfactorystainingofeachgroupwerelistedinTable2.GCL=ganglioncellslayer;ONL=theOuternuclearlayer;OPL=Outerplexiformlayer;INL=Innernuclearlayer;IPL=Innerplexiformlayer.Thescalebaris100mm.表2六組視網(wǎng)膜Pax6染色情況(%)Table2IFstainingofPax6insectionsfromthesixgroupsNote:datawereanalyzedwithchi-squaretest.x2=316.9,P<0.0001.是：節(jié)細胞層(GCL)、內(nèi)網(wǎng)狀層(Innerplexiformlayer,IPL)、內(nèi)核層(INL)、外網(wǎng)狀層(Outerplexiformlayer,OPL)和外核層(ONL)，在外核層的外側(cè)，則依次分布著感受器細胞的內(nèi)段(innerseg-ment)和外段(outersegment)[23,24]。節(jié)細胞層中包含著大量的神經(jīng)節(jié)細胞和少量錯置的無長突細胞；內(nèi)核層則包含水平細胞、雙極細胞、無長突細胞這三種中間神經(jīng)元以及Müller氏膠質(zhì)細胞；外核層由視桿細胞和視錐細胞兩種感光細胞的胞體組成[25,26]。針對神經(jīng)視網(wǎng)膜的神經(jīng)元，以往研究也已經(jīng)積累了豐富的相關(guān)抗原標記物的知識[27]。視神經(jīng)節(jié)細胞可以用抗Brn3抗體、抗Pax6抗體來標記；水平細胞可以被抗NF-M抗體識別；雙極細胞使用抗PKC-α抗體來染色；無長突細?

陽性的視桿細胞位于視網(wǎng)膜分層的底層，不易通過浸泡滲透的方法進行固定，從而對位于視桿細胞OS外段部分的Rhodopsin抗原不能很好地保存。P+I2組和P+I12組的Rhodopsin染色結(jié)果較好，則說明灌注固定的方法能夠?qū)ι顚拥耐舛尾糠诌M行很好的固定，可以與浸泡固定互相補充、互相輔助。再次，對視網(wǎng)膜其他抗原進行染色的結(jié)果進一步驗證了P+I12為最優(yōu)組織固定方法，可以滿足神經(jīng)視網(wǎng)膜組織中各種細胞的免疫熒光染色�？傊�，綜合大體組織形態(tài)、Pax6和Rhodopsin兩種IF染色以及其他抗原染色的結(jié)果，染色最差的是I2組和P組，染色中圖36種不同后固定方法處理后小鼠視網(wǎng)膜的Rhodopsin免疫熒光組織化學染色結(jié)果Fig.3IFstainingofRhodopsinonmouseretinaethatwerefixedbysixdifferentmethodsNote:A:SectionnofI2groupshowedveryweakpositivestainingintheoutersegmentpart(OS)andsomenon-specificstaininginotherlayers.B:SectionnofI12groupshowedpositivestaininginOSbutalsosomenon-specificstaininginotherlayers.C:SectionnofI24groupshowedweakstaininginOS.D:SectionnofP+I2groupshowedaconfusedstainingresultsofRhodopsin.E,F:SectionsofP+I2groupandP+I12groupbothshowedsatisfactorypositivestainingspecificallyinOS.GCL=ganglioncellslayer;ONL=theOuternuclearlayer;OPL=Outerplexiformlayer;INL=Innernuclearlayer;IPL=Innerplexiformlayer.OS=outersegments;IS=innersegmentsThescalebaris100μm.表3六組視網(wǎng)膜Rhodopsin染色情況(%)Table3IFstainingofRhodopsininsectionsfromthesixgroupsGroupsAmount(n)RateofSatisfactoryStainingRateofDissatisfactoryStainingI2Group60100I12Group60100I24Group65050PGroup60100P+I2Group683.3316

【參考文獻】：
期刊論文
[1]冰凍切片制作及免疫組化的改進[J]. 趙麗微,楊淑艷,方青.  吉林醫(yī)藥學院學報. 2009(01)
[2]視網(wǎng)膜建模的研究進展[J]. 牛希嫻,童善保,朱貽盛,邱意弘.  生物醫(yī)學工程學雜志. 2008(04)



本文編號：2973150