目的利用大腸桿菌高效表達(dá)并純化E型肉毒神經(jīng)毒素（BoNT/E）受體結(jié)合區(qū)Hc的亞結(jié)構(gòu)域EHc-C蛋白,并進(jìn)行免疫原性研究。方法利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出EHc-C基因,克隆于載體pTIG-Trx-His-tag中得到重組質(zhì)粒pTIG-Trx-EHc-C,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3）,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,超聲破碎菌體,收集上清,經(jīng)鎳柱親和純化獲得重組抗原EHc-C蛋白,通過SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)純化效果,之后免疫BALB/c小鼠,評(píng)價(jià)其免疫原性。結(jié)果通過原核表達(dá)純化獲得了純度>90%的重組抗原EHc-C蛋白,該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng),10μg劑量抗原蛋白3次免疫小鼠即可抵抗104LD50E型肉毒毒素攻擊,血清中和抗體效價(jià)可達(dá)1.00 U/ml。結(jié)論獲得的重組EHc-C抗原免疫原性良好,免疫小鼠后能抵抗E型肉毒毒素的攻擊,產(chǎn)生強(qiáng)烈保護(hù)作用,可作為亞單位候選疫苗預(yù)防E型肉毒毒素中毒或用于研究肉毒毒素疫苗和抗體的功能表位。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學(xué). 2019年05期 第346-351頁 北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

pTIG-Trx-EHc-C菌落PCR鑒定圖

軍事醫(yī)學(xué)2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱對(duì)重組EHcC蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小，且咪唑濃度為100mmol/L時(shí)純度達(dá)到了電泳級(jí)。Western印跡證實(shí)該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合，具有E型毒素的抗原性（圖3）。圖2EHc-C誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物；1.未加IPTG誘導(dǎo)對(duì)照；2.包涵體；3.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清；4.誘導(dǎo)表達(dá)全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物；1.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白；3.穿過液；4.脫鹽蛋白；5，6.Western印跡檢測(cè)表達(dá)純化產(chǎn)物：5.一抗為抗EHc抗體；6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應(yīng)的測(cè)定采用ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠血清中的體液免疫反應(yīng)，第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強(qiáng)，陰性對(duì)照組的抗體水平無變化（圖4），表明此重組抗原免疫原性良好；抗體滴度的結(jié)果表明，EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200，最高滴度為1∶6400；第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200，最高滴度為1∶409600（圖5），相對(duì)于第2次免疫的抗體滴度，第3次有明顯的增強(qiáng)，該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng)；此外，還對(duì)免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進(jìn)行了測(cè)定，抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1（圖6），即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更傾向于Th2

?2019年5月第43卷第5期MilMedSci，Vol43，No5，May，2019柱對(duì)重組EHcC蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)純化得到的蛋白符合目的蛋白的理論大小，且咪唑濃度為100mmol/L時(shí)純度達(dá)到了電泳級(jí)。Western印跡證實(shí)該重組EHcC能特異性與抗EHc血清抗體、抗E型毒素的抗體結(jié)合，具有E型毒素的抗原性（圖3）。圖2EHc-C誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物；1.未加IPTG誘導(dǎo)對(duì)照；2.包涵體；3.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清；4.誘導(dǎo)表達(dá)全菌圖3EHc-C純化后SDS-PAGE和Western印跡鑒定M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志物；1.誘導(dǎo)表達(dá)破菌上清；2.100mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白；3.穿過液；4.脫鹽蛋白；5，6.Western印跡檢測(cè)表達(dá)純化產(chǎn)物：5.一抗為抗EHc抗體；6.一抗為抗E型毒素的抗體22.2重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應(yīng)的測(cè)定采用ELISA方法檢測(cè)免疫后小鼠血清中的體液免疫反應(yīng)，第3次免疫后較第2次的抗體水平迅速增強(qiáng)，陰性對(duì)照組的抗體水平無變化（圖4），表明此重組抗原免疫原性良好；抗體滴度的結(jié)果表明，EHcC抗原免疫組第2次免疫抗體滴度的平均值為1∶3200，最高滴度為1∶6400；第3次免疫抗體滴度平均值為1∶307200，最高滴度為1∶409600（圖5），相對(duì)于第2次免疫的抗體滴度，第3次有明顯的增強(qiáng)，該重組抗原作為亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生了特異性抗體反應(yīng)；此外，還對(duì)免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞型進(jìn)行了測(cè)定，抗原EHcC免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1（圖6），即提示此抗原免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更傾向于Th2型免?


本文編號(hào)：2907750