為探討27nt-miRNA對間充質干細胞向血管平滑肌細胞分化影響,構建27nt-miRNA過表達、反義序列Anti-27nt-miRNA以及陰性對照的表達質粒,慢病毒包裝后分別轉染人臍帶間充質干細胞（hUCMSC）,加入Ⅳ型膠原誘導hUCMSC定向分化為血管平滑肌細胞。四唑鹽（MTT）比色法檢測分化后細胞活力,免疫細胞化學染色法檢測分化后細胞SM22α（兔抗平滑肌22α,smooth muscle 22α）的表達,Western印跡法和RT-PCR檢測分化后細胞內的SMA （兔抗平滑肌肌動蛋白,smooth muscle actin） mRNA、SM 22α mRNA及其蛋白質表達情況。經檢測,27nt-miRNA過表達分化組與陰性對照組相比,細胞活力下降20.48%（P<0.05）,SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白質表達量明顯升高（P<0.05）;而Anti-27nt-miRNA分化組細胞活力上升了18.07%（P<0.05）,SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白質表達量下降（P<0.05）。綜上所述,27nt-miRNA能夠促進間充質... 

【文章來源】：生物工程學報. 2019年02期 第290-297頁 北大核心

【文章頁數】：8 頁

【部分圖文】：

顯微鏡下觀察到hUCMS的轉染情況

ISSN1000-3061CN11-1998/Q生物工程學報ChinJBiotechhttp://journals.im.ac.cn/cjbcn294圖2MTT檢測27nt-miRNA對細胞活力影響Fig.2MTTdetectstheeffectof27nt-miRNAoncellviability.xs.n=3.*P<0.05vs.NC.P<0.05)，而Anti-27nt-miRNA組升高18.07%(0.83±0.03vs.0.98±0.07，P<0.05)。以上結果提示，27nt-miRNA抑制hUCMSC分化后細胞的活力。2.327nt-miRNA對VSMC分化標志物SM22α表達的影響用免疫細胞化學染色方法(ICC)檢測分化后各組細胞中的VSMC特異性蛋白SM22α的表達量，如圖3所示，SM22α蛋白主要表達于細胞胞漿，陽性染色呈棕黃色顆粒。運用IPP6.0軟件對SM22α蛋白表達量進行計算：平均光密度(Meanopticaldensity)越大，SM22α蛋白表達越高。與陰性對照NC組比較，27nt-miRNA組SM22α表達量增加63.64%(0.22±0.02vs.0.36±0.04，P<0.05)；而Anti-27nt-miRNA組SM22α表達量下降36.36%(0.22±0.02vs.0.14±0.03，P<0.05)。結果提示，27nt-miRNA促進了VSMC分化標志物SM22α表達。2.4RT-PCR檢測27nt-miRNA對SMAmRNA和SM22αmRNA的影響用RT-PCR檢測分化后各組細胞的SMAmRNA、SM22αmRNA的表達水平(圖4)。與陰圖3免疫組化檢測27nt-miRNA對細胞SM22α蛋白表達的影響Fig.3Effectof27nt-miRNAontheproteinexpressionofSM22αwasdetectedbyimmunohistochemistry,xs.n=3,*P<0.05vsNC.圖4PT-PCR檢測27nt-miRNA對SMAmRNA和SM22αmRNA表達的影響Fig.4Effectof27nt-miRNAonthemRNAexp

SM22α表達量下降36.36%(0.22±0.02vs.0.14±0.03，P<0.05)。結果提示，27nt-miRNA促進了VSMC分化標志物SM22α表達。2.4RT-PCR檢測27nt-miRNA對SMAmRNA和SM22αmRNA的影響用RT-PCR檢測分化后各組細胞的SMAmRNA、SM22αmRNA的表達水平(圖4)。與陰圖3免疫組化檢測27nt-miRNA對細胞SM22α蛋白表達的影響Fig.3Effectof27nt-miRNAontheproteinexpressionofSM22αwasdetectedbyimmunohistochemistry,xs.n=3,*P<0.05vsNC.圖4PT-PCR檢測27nt-miRNA對SMAmRNA和SM22αmRNA表達的影響Fig.4Effectof27nt-miRNAonthemRNAexpressionofSMAmRNAandSM22αmRNAwasdetectedbyRT-PCR.xs.n=3.*P<0.05vsNC.性對照NC組比較，27nt-miRNA組的SM22αmRNA表達量增加31.40%(0.86±0.03vs.1.13±0.08，P<0.05)、SMAmRNA表達量上升25.00%(0.72±0.03

【參考文獻】：
期刊論文
[1]27-nt miRNA對血管內皮細胞eNOS表達/活性的調節(jié)及其代謝產物的影響[J]. 羅雪蘭,陳偉,莫國君,楊鵬,歐和生.  現代生物醫(yī)學進展. 2017(08)
[2]內含子源性miRNA通過轉錄因子AP1調節(jié)內皮型一氧化氮合酶表達及血管內皮細胞增殖作用[J]. 李玉媚,王輝,張文宇,陳偉,胡楠,歐和生.  中國動脈硬化雜志. 2014(07)



本文編號：2899923