背景和目的:肝細(xì)胞材料已成為限制生物人工肝（bioartificial liver, BAL）及肝細(xì)胞移植（hepatocytes transplantation, HTX）發(fā)展的瓶頸問題,這一問題的解決必將大大提升BAL及HTX的臨床實(shí)用價(jià)值。理論上講,人肝細(xì)胞（包括成人肝細(xì)胞及人胎肝細(xì)胞）最為理想,但成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植,加之成人肝細(xì)胞在體外增殖能力差,故大量獲得成人肝細(xì)胞是不可能的。胎肝的利用因涉及倫理問題,亦難以推廣應(yīng)用。使用動(dòng)物肝細(xì)胞又存在發(fā)生免疫反應(yīng)及傳播動(dòng)物病毒的危險(xiǎn)。肝細(xì)胞株（如HepG2、C3A、HHY41、HepZ等）分化功能較原代肝細(xì)胞差,且多為瘤源性或由原代肝細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染獲得,存在安全性問題�？苫貜�(fù)性永生化程序?yàn)榻鉀Q細(xì)胞材料問題提供了新的思路及手段。其基本原理是先將永生化基因猿猴病毒40大T抗原基因（simian virus 40 large T antigen gene, SV40T）導(dǎo)入原代細(xì)胞以獲得永生化細(xì)胞株,使其獲得體外增殖能力,然后再以特異性位點(diǎn)重組技術(shù)切除SV40T基因,使細(xì)胞株回復(fù)到永生化前的狀態(tài),這樣細(xì)胞既得到了增殖又不具有致癌... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

可回復(fù)性永生化載體構(gòu)建新策略

14圖 1-1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLXSN 及其多克隆位點(diǎn)結(jié)構(gòu)組陽性克隆的鑒定R 法：在 20μl 反應(yīng)體系中加入無菌水 19.2μl，2×PCR 混合液 10μl，2 引物各 0.4μl 使其終濃度為 1μM，用高壓滅菌牙簽或無菌吸頭沾取入反應(yīng)體系中。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 分鐘；然后 94℃30s，58 30 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 10 分鐘。將 PCR 產(chǎn)物加到 1%瓊脂糖凝分離出 784bp 條帶者為陽性。切法：取 PCR 陽性克隆接種于 5ml 含 100U/ml 氨芐青霉素的 LB 培 250r/分鐘振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA，用 BamHⅠ和，1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，以 pLXSN 行相同雙酶切作為對(duì)照。

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文述方法篩選的陽性克隆質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行測(cè)序分析，由上海生成，引物為 pLXSN 產(chǎn)品自帶測(cè)序引物 P5'。結(jié) 果態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率 質(zhì)粒 pUC18 轉(zhuǎn)化 50μl 感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化原液體積為 250μh 后，長出 1000 多個(gè)菌落（圖 1-2）。而受體菌對(duì)照平板未率約為 108轉(zhuǎn)化體/μg 超螺旋質(zhì)粒（轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2899048