戊型肝炎(hepatitis E, HE)是繼甲型肝炎外另一種經(jīng)腸道傳播的嚴重危害人類健康的病毒性肝炎。戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)是其病原體,為單股正鏈RNA病毒。明確HEV的基因型對于戊型肝炎的診斷、預防及流行病學具有重要意義。 目前,HEV基因分型尚無統(tǒng)一標準,存在很多問題與分歧。由于全基因組測序費時費力,大多數(shù)研究者通過測定HEV基因組部分序列進行基因分型,而用于分型的基因組區(qū)段至今還未達成統(tǒng)一,給各HEV基因分型研究結果的比較造成很大困難。其次,HEV基因分型采用的標準不盡相同。部分學者以核苷酸同源性低于20%為標準,而有些以15%為標準,還有部分學者以遺傳距離作為基因分型標準。隨著更多的HEV毒株的分離測序,標準的不確定性嚴重影響了HEV的基因分型結果,尤其基因亞型的判別更為困難。此外,HEV基因分型的命名方法也存在混亂之處,羅馬數(shù)字與阿拉伯數(shù)字混用,同一分離株被命名為不同基因型。 針對HEV基因分型的現(xiàn)狀,本研究通過設計通用性引物,嘗試利用逆轉錄-巢式聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增各基因型HEV基因組部分序列,并與文獻已報道的通用性引物擴增的PCR片段比較,篩選最適的HEV基因組區(qū)段以替代全序列進行HEV基因分型,從而統(tǒng)一用于HEV基因分型的基因組區(qū)段。同時利用全基因序列計算所得數(shù)據(jù),建立用于HEV基因分型的基因同源性及遺傳距離的標準,并在基因分型的同時提出統(tǒng)一的命名規(guī)則,使HEV基因分型進一步標準化。本研究實驗內(nèi)容主要包括以下兩部分: 基于不同基因組區(qū)段進行HEV基因分型 根據(jù)GenBank中已登錄的37株不同基因型HEV全序列,在HEV序列保守區(qū)設計MJ-A、MJ-B、MJ-C、MJ-D 4組引物,同時檢索文獻找出其它已有報道的20組通用性引物。通過兩因素及單因素統(tǒng)計學方法,分析基于24組引物擴增區(qū)段的基因同源性和遺傳距離數(shù)據(jù)與基于全序列的數(shù)據(jù)在不同基因型及同一基因型內(nèi)有無差異,找出與全序列無統(tǒng)計學意義的區(qū)段;比較基于該區(qū)段及基于基因組全序列進行的系統(tǒng)進化分析結果,進一步證明該區(qū)段可替代全序列用于基因分型。依據(jù)全序列計算所得的遺傳距離、基因同源性,建立HEV的分型標準,以系統(tǒng)進化分析驗證。 研究結果表明,以基因同源性為統(tǒng)計數(shù)據(jù),利用Dunnett-t及SNK-q兩種統(tǒng)計學方法,在兩因素及單因素方差分析中,僅有位于HEV RNA多聚酶功能域的MJ-C組引物PCR擴增區(qū)段與全序列分析數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學差異,可在不同基因型間及同一基因型內(nèi)均可替代全序列進行基因分型;以遺傳距離為統(tǒng)計數(shù)據(jù),引物GV-A擴增區(qū)段可替代全序列進行基因分型,但無法替代I型內(nèi)部HEV的分型。 以37株全基因組HEV統(tǒng)計數(shù)據(jù)為參照,現(xiàn)有HEV基因型及亞型分型標準分別為:基因型間遺傳距離大于0.30,核苷酸差異大于24%;基因亞型間遺傳距離大于0.11,核苷酸差異大于10%。按照這一標準,結合系統(tǒng)進化分析,37株HEV分為I~IV基因型及若干亞型。基于MJ-C擴增區(qū)段的基因分型結果與全序列分型完全一致。 二、通用性引物RT-PCR擴增不同基因型HEV 用篩選得到的最適引物MJ-C進行RT-PCR擴增I~IV型HEV標準株,檢測其通用性,并用于HEV IgM陽性的臨床標本RT-PCR檢測及基因分型。 結果顯示MJ-C可以擴增各型HEV標準株;38份臨床標本,13份測出特異性HEV RNA,陽性率35%。13份樣本均為IV型HEV,進一步可分為4種基因亞型。 WP=5 綜上,本研究通過生物信息學及統(tǒng)計學方法分析,成功篩選出位于HEV RNA多聚酶功能域的基因組區(qū)段(4254~4560nt)可以替代HEV基因組全序列進行基因分型,該區(qū)段側翼序列保守,可用于擴增不同基因型HEV;同時基于全基因組序列分析,建立HEV基因分型標準為基因型間遺傳距離大于0.30,核苷酸差異大于24%;基因亞型間遺傳距離大于0.11,核苷酸差異大于10%;此外,本研究首次明確提出HEV基因型的系統(tǒng)命名法:以羅馬數(shù)字和26個英文小寫字母分別作為基因型及基因亞型序號,以毒株分離時間先后作為命名順序。上述標準的建立,必將解決HEV基因分型中的眾多分歧,進一步完善與促進HEV基因分型的研究。
【學位單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R373.2
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
縮略詞表
目錄
前言
文獻綜述
第一章
    材料與方法
    結果
    分析與討論
第二章
    材料與方法
    結果
    分析與討論
結論
參考文獻
作者簡介
后記

【引證文獻】

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1 郝寶成;蘭喜;刑小勇;項海濤;胡永浩;柳紀省;梁劍平;;豬戊型肝炎病毒分子生物學與流行病學研究進展[J];中國動物傳染病學報;2010年05期

本文編號：2882079