TLR9是模式識別受體TLR家族中的一員,主要識別含有CpG基序的寡核苷酸CpG ODN,從而啟動天然免疫應(yīng)答。但TLR9的異�；蜻^度活化會導(dǎo)致生理功能紊亂和疾病的發(fā)生。Rab7是一類定位于晚期內(nèi)體／溶酶體結(jié)構(gòu)的小G蛋白,已經(jīng)有研究表明,Rab7參與到多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。但關(guān)于Rab7對TLR9的信號通路的研究卻相對較少。目的：研究Rab7對TLR9活化后產(chǎn)生的I型IFN和其它細(xì)胞因子以及對MAPK信號通路的影響,并探討其作用機制。方法：(1)采用siRNA干擾技術(shù),沉默RAW264.7細(xì)胞中的Rab7基因,Real timePCR和Western blot檢測TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化,Real time PCR檢測TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-α、IFN-β、IP-10和iNOS細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的變化,Western blot檢測TLR9下游信號通路中ERK、JNK、 p38的磷酸化水平變化。(2)將Rab7真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1/mRab7)、C末端缺失質(zhì)粒(pcDNA3.1/ Rab7△C)和T22N突變質(zhì)粒(pcDNA3.1/Rab7T22N)通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞RAW264.7, G418篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)Rab7及其突變體的細(xì)胞系。以這些細(xì)胞系為模型,Real time PCR和Western blot檢測CpG刺激后TLR9 mRNA和蛋白水平變化,及TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-β細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的變化,Western blot檢測TLR9下游信號通路中ERK、JNK、p38的磷酸化水平變化。(3)分別對四種細(xì)胞系使用ERK、JNK、p38、NF-κB抑制劑PD98059, SP600125, SB203580, PDTC預(yù)處理30min, ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-β和IL-10分泌的變化。結(jié)果：(1)Rab7基因沉默后TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯降低；Rab7過表達(dá)后TLR9 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著升高,Rab7突變后TLR9mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低。(2)Rab7基因沉默后TNF-α、IL-1β、IL-10、IFN-α、IFN-β、 IP-10和iNOS mRNA的表達(dá)水平顯著升高；Rab7過表達(dá)后TNF-α、IL-1β、IFN-α、 IFN-β的表達(dá)水平顯著降低,Rab7突變后TNF-α、IL-1β、IFN-α、IFN-β的表達(dá)水平顯著升高。(3)Rab7基因沉默后ERK、p38的磷酸化水平明顯升高,JNK的磷酸化水平顯著降低：Rab7過表達(dá)后ERK和p38的磷酸化水平明顯下降,Rab7 C端缺失后ERK和p38的磷酸化水平明顯升高,Rab7T22N突變后ERK、p38的磷酸化水平無明顯變化。(4)Rab7突變后,與DMSO處理的對照組相比,SP60015預(yù)處理后CpG刺激不能促進(jìn)IFN-β的分泌,而抑制劑PD98059, SB203580, PDTC預(yù)處理后則沒有類似作用；CpG刺激8h后,抑制劑SB203580和PDTC預(yù)處理不能促進(jìn)IL-10的分泌,抑制劑PD98059,SP60015預(yù)處理后沒有類似作用。結(jié)論：(1)Rab7促進(jìn)TLR9的表達(dá)。(2)Rab7以C端依賴的方式抑制TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ERK和p38 MAPK信號通路。(3)Rab7抑制細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、 IFN-α和IFN-βmRNA的表達(dá)。(4)Rab7通過JNK MAPK途徑調(diào)節(jié)IFN-β的分泌,通過p38 MAPK和NF-κB信號途徑來調(diào)節(jié)IL-10的分泌。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 引言
    1.1 Rab蛋白家族介紹
        1.1.1 Rab循環(huán)
        1.1.2 Rab蛋白的膜靶標(biāo)
        1.1.3 Rab7簡介
    1.2 Toll樣受體家族介紹
        1.2.1 TLRs簡介
        1.2.2 TLR9與配體
        1.2.3 TLR9活化后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
        1.2.4 TLR9與疾病
    1.3 研究目的與意義
2 Rab7對巨噬細(xì)胞中TLR9活化后產(chǎn)生的Ⅰ型IFN的調(diào)控及機制研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細(xì)胞株及主要試劑
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 主要試劑配制
        2.1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠與濃縮膠的配制
        2.1.5 熒光定量引物序列
    2.2 實驗方法
        2.2.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7
        2.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選
        2.2.4 細(xì)胞總RNA提取
        2.2.5 cDNA的制備
        2.2.6 Real time PCR檢測
        2.2.7 細(xì)胞蛋白提取及BCA法蛋白含量的測定
        2.2.8 SDS-PAGE電泳
        2.2.9 Western Blot檢測
        2.2.10 ELISA試劑盒檢測
3 結(jié)果分析
    3.1 siRNA干擾后Rab7 mRNA的表達(dá)
    3.2 Rab7對TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響
        3.2.1 Rab7基因沉默后對TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響
        3.2.2 Rab7過表達(dá)和突變后對TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響
        3.2.3 小結(jié)
    3.3 Rab7對TLR9活化后產(chǎn)生的Ⅰ型IFN和其它下游信號因子mRNA表達(dá)水平的影響
        3.3.1 Rab7基因沉默后對TLR9活化后產(chǎn)生的Ⅰ型IFN和其它下游信號因子mRNA表達(dá)水平的影響
            3.3.1.1 Rab7基因沉默后對CpG刺激的TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA表達(dá)的影響
            3.3.1.2 Rab7基因沉默后對CpG刺激的IFN-α、IFN-β mRNA表達(dá)的影響
            3.3.1.3 Rab7基因沉默后對CpG刺激的IP-10 mRNA表達(dá)的影響
            3.3.1.4 Rab7基因沉默后對CpG刺激的iNOS mRNA表達(dá)的影響
        3.3.2 Rab7過表達(dá)和突變后對TLR9活化后產(chǎn)生的Ⅰ型IFN和其它下游信號因子mRNA表達(dá)水平的影響
            3.3.2.1 Rab7過表達(dá)和突變后對TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)的影響
            3.3.2.2 Rab7過表達(dá)和突變后對IFN-α和IFN-β mRNA表達(dá)的影響
        3.3.3 小結(jié)
    3.4 Rab7對TLR9下游MAPK信號通路的影響
        3.4.1 Rab7基因沉默后對TLR9下游MAPK信號通路的影響
        3.4.2 Rab7基因過表達(dá)和突變后對TLR9下游MAPK信號通路的影響
        3.4.3 小結(jié)
    3.5 ERK、JNK、p38、NF-κB抑制劑預(yù)處理后,Rab7過表達(dá)及突變后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-β和IL-10分泌的變化
4 討論
5 結(jié)論
6 展望
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介

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本文編號：2881235