研究背景:指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(SELEX)技術系指在體外從人工合成的ssDNA或RNA 隨機序列庫中尋找與靶分子特異結(jié)合片段的過程,其實質(zhì)是試管中的人工進化。篩選出的分子稱為核酸適體(aptamer)。隨機庫中核酸分子空間構(gòu)象的多樣性是核酸分子與其它分子相互作用的基礎。核酸適體代表著一類功能與抗體相似的新型分子,它的靶分子廣、分辨率高、化學修飾便利、組織穿透能力強等特點,令其在基礎研究、臨床診斷、藥物研制方面得以廣泛應用。目前,VEGF、癌細胞表面特定蛋白Nucleolin及凝血酶的核酸適體已進入臨床試驗階段。 TGF-βs在纖維化病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,其受體主要分三型:TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ。TGF-βRⅢ主要負責將間質(zhì)中的TGF-βs傳遞給TGF-βRⅡ并增強它們之間的親和性。TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ均屬跨膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族,其中TGF-βRⅡ能自由地與TGF-βs結(jié)合,而TGF-βRⅠ僅能識別配體與TGF-βRⅡ形成的復合物并被激活。激活的TGF-βRⅠ可進一步磷酸化下游的信號分子如Smad,引起Smad向核內(nèi)轉(zhuǎn)位,從而介導TGF-βs的一系列生物學效應。因此,以TGF-βRⅡ蛋白為靶點篩選和研制其拮抗劑,封阻TGF-βs的生物學活性,對于纖維化病變的防治具有積極意義。迄今為止,還未見TGF-βRⅡ核酸適體的研究報道。本研究初步探討了利用SELEX技術從ssDNA隨機庫中富集TGF-βRⅡ親和核酸庫的方法,為后續(xù)分離TGF-βRⅡ單一核酸適體,獲取TGF-βRⅡ新型拮抗劑奠定了基礎。 材料與方法: 1. 初始ssDNA隨機庫的構(gòu)建 設計中間含60個隨機堿基、兩端為固定序列、總長108nt的ssDNA模板,交由公司合成。產(chǎn)品已做去保護及純化處理。 2. SELEX篩選 1) 首輪篩選:直接取適量合成的ssDNA做為初始篩選庫(ssDNA-0),初始庫容量 WP=10 為1.2×1015。靶蛋白TGF-βRⅡ與ssDNA-0溫育后,反應混合液上樣到硝酸纖維素膜上,真空抽濾,洗脫游離核酸。7M尿素、酚/氯仿回收膜上滯留的ssDNA。行PCR擴增時,采用5(端生物素化的下游引物,使PCR產(chǎn)物偶聯(lián)上生物素。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物。利用Streptavidin-Agarose捕獲dsDNA,0.15N的 NaOH使雙鏈變性,釋放非生物素標記的ssDNA,回收后用于第2輪篩選。 2) 第2～4輪篩選:將靶蛋白TGF-βRⅡ預先吸附到固相基質(zhì)Phenyl-Agarose上,然后與ssDNA富集庫溫育,洗脫未結(jié)合核酸,回收與TGF-βRⅡ結(jié)合的ssDNA。擴增、富集、分離目的ssDNA步驟同前。從第3輪篩選始,引入針對固相基質(zhì)Phenyl-Agarose的反向篩選。 3) 第5～8輪篩選:與第3～4輪篩選相比,做兩點調(diào)整:(1)反向篩選調(diào)整為:富集庫與預先吸附了BSA的固相基質(zhì)Phenyl-Agarose溫育。(2)篩選時,向篩選緩沖體系中加入酵母tRNA。隨著篩選的進行,嚴謹度不斷增加。 3. 監(jiān)測富集庫進化狀態(tài) 1) 膜結(jié)合測定實驗: 將 32P放射性標記的初始庫、富集庫分別與TGF-βRⅡ及BSA溫育,反應混合液上樣到硝酸纖維素膜上,負壓抽濾,空氣中干燥濾膜。液閃儀計數(shù)CPM值。以百分值〔(核酸蛋白組膜上放射殘留量-單純核酸組膜上放射殘留量)/投入反應核酸的放射總量〕×100%估算核酸庫對靶蛋白的親和程度。 2) 凝膠遷移阻滯實驗:將32P放射性標記的初始庫、富集庫分別與TGF-βRⅡ及BSA溫育,反應混合液上樣到4%非變性聚丙烯酰胺凝膠中,電泳,放射自顯影。 結(jié)果:第8輪富集庫對靶蛋白TGF-βRⅡ的親和力較初始隨機庫提高了22.61倍,有非常顯著的差異(P0.01)。在第8輪富集庫+TGF-βRⅡ組泳道中觀察到核酸-蛋白復合物滯后帶。同時,雖然第8輪富集庫對BSA的親和力較原始庫亦提高了11.33倍,但在凝膠遷移阻滯實驗中觀察不到BSA/ssDNA復合物滯后帶,說明富集庫ssDNA-8與BSA的結(jié)合系非特異性的。 結(jié)論:經(jīng)過8輪循環(huán)篩選,終極富集庫對靶蛋白TGF-(RⅡ的親和力獲得了一定程度的提高,確實向著特異親和靶蛋白TGF-(RⅡ的方向進化。本研究工作為后續(xù)分離TGF-(RⅡ單一核酸適體、獲取TGF-(RⅡ新型拮抗劑奠定了基礎。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖 2. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. DNA smear 現(xiàn)象2. 全長 dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長 ssDNA(目的片段)2. 非完全擴增片段3. 二甲苯藍染料← 1← 23 →

圖 2. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. DNA smear 現(xiàn)象2. 全長 dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長 ssDNA(目的片段)2. 非完全擴增片段3. 二甲苯藍染料← 1← 23 →

第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%非變性酰胺凝膠電泳圖NA smear 現(xiàn)象長 dsDNA(目的片段)圖 3. 第 1 輪 PCR 產(chǎn)物 8%/8M 尿變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖1. 全長 ssDNA(目的片段)2. 非完全擴增片段3. 二甲苯藍染料← 1← 2← 1← 2
【引證文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 陳號;適體篩選過程中檢測方法的初步探索[D];西南大學;2010年

2 馬文靜;適體篩選方法及分離方法的探討[D];西南大學;2010年

本文編號：2874978