目的:建立大鼠高血壓致慢性心力衰竭模型,按照分組進(jìn)行心肌細(xì)胞快速分離,在共聚焦顯微鏡下觀測(cè)鈣信號(hào)及單位釋放事件鈣火花,并通過(guò)研究與興奮收縮偶聯(lián)相關(guān)蛋白Junctophilin-2(JP-2)及鈣回?cái)z相關(guān)蛋白SERCA2a蛋白量的變化與鈣火花變化的相關(guān)性。探討高血壓致慢性心力衰竭的演變過(guò)程及在其在病理狀態(tài)下鈣信號(hào)變化及其鈣循環(huán)過(guò)程的相關(guān)機(jī)制變化。方法:1.將實(shí)驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)原則分成兩組,心衰模型組(n=40)與假手術(shù)對(duì)照組(n=26)。2.將心衰模型組大鼠采用腹主動(dòng)脈縮窄法(TAC)建立壓力超負(fù)荷高血壓致心衰模型。假手術(shù)對(duì)照組只開腹穿線,不結(jié)扎,其他同法操作。3.對(duì)術(shù)后成活的大鼠定期進(jìn)行尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)及酶聯(lián)免疫ELISA法檢測(cè)心衰標(biāo)志物BNP的表達(dá)量,用于判斷確定高血壓致心衰模型是否成功。4.造模4周初步成功后將兩組大鼠分別于術(shù)后的4周、6周、8周、10周、12周急性獲取心臟,消化獲得單個(gè)心室肌細(xì)胞,并用于后續(xù)檢測(cè)。5.激光共聚焦顯微鏡與膜片鉗聯(lián)用,觀察并記錄心室肌細(xì)胞鈣活動(dòng)及單位釋放事件鈣火花的發(fā)生。6.蛋白印記法檢測(cè)心肌細(xì)胞興奮收縮偶聯(lián)結(jié)構(gòu)蛋白JP2及鈣回?cái)z蛋白SERCA2a隨著心衰的發(fā)展的表達(dá)情況,評(píng)估高血壓心衰發(fā)展過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:1.大鼠術(shù)后體征及高血壓造模成功率手術(shù)成功的大鼠在3~6h內(nèi)能夠恢復(fù)清醒,12h左右可以進(jìn)食,精神狀態(tài)良好。心衰模型組的成活率為70.0%,在成活的模型大鼠中復(fù)制高血壓成功率為89.2%;假手術(shù)組大鼠成活率為96.1%。2.大鼠術(shù)后尾動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)結(jié)果大鼠正常血壓在13~15kpa左右,在手術(shù)完成初期,衰模型組血壓與假手術(shù)組大鼠的血壓差異不明顯(P0.05);術(shù)后第21天,心衰模型組血壓明顯高于對(duì)照組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);術(shù)后第28天,心衰模型組血壓持續(xù)上升(P0.05),并高于對(duì)照組血壓(P0.05);術(shù)后56天、63天模型組血壓出現(xiàn)下降(P0.05),此時(shí)血壓值仍然高于對(duì)照組(P0.05);術(shù)后84天,模型組大鼠血壓持續(xù)下降(P0.05),血壓值與高于對(duì)照組(P0.05)。對(duì)照組組間比較沒(méi)有差異(P0.05)。3.心衰標(biāo)志物B型腦鈉肽(BNP)檢測(cè)結(jié)果大鼠心衰模型組BNP水平在第4周時(shí)明顯升高,心衰模型組的血漿BNP水平明顯高于對(duì)照組(P0.05),同時(shí)期心衰模型組大鼠BNP水平高于對(duì)照組(P0.05);心衰組的BNP水平隨著心衰的進(jìn)程逐漸升高(P0.05),組間差異明顯;4.大鼠急性分離心肌細(xì)胞結(jié)果狀態(tài)良好的單個(gè)心肌細(xì)胞呈桿狀,細(xì)胞成活率在80%左右。在顯微鏡下觀察,60%以上的細(xì)胞呈明顯的長(zhǎng)桿狀,活性良好。5.心肌細(xì)胞鈣火花形態(tài)特征觀察結(jié)果與假手術(shù)組對(duì)比,最初兩組觀察到的鈣火花差異不是很明顯(P0.05);隨著心衰的發(fā)展,心衰模型組的心肌細(xì)胞觀察到的鈣火花在時(shí)空形態(tài)上都有明顯的差異,心衰模型組的鈣火花幅度降低(P0.05)、達(dá)峰時(shí)間延長(zhǎng)(P0.05)、持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)(P0.05)。隨著心衰的發(fā)展,細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,心肌細(xì)胞對(duì)于電位逐漸反應(yīng)失敏,結(jié)構(gòu)決定現(xiàn)象,鈣火花發(fā)生變化有其結(jié)構(gòu)的改變。6.Western blot檢測(cè)結(jié)果心衰模型組大鼠檢測(cè)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,心衰模型組的大鼠在第4周JP2蛋白就表達(dá)水平不變(P0.05),第8周模型組蛋白表達(dá)低于對(duì)照組的蛋白表達(dá)(P0.05);隨著心衰的進(jìn)程發(fā)展,心衰模型組大鼠蛋白表達(dá)量逐漸下降(P0.05),到第10周、12周時(shí),蛋白表達(dá)沒(méi)有差異性(P0.05);對(duì)照組間穩(wěn)定表達(dá),沒(méi)有差異性(P0.05)。SERCA2a蛋白印記結(jié)果顯示,心衰模型組的大鼠在第4周SERCA2a蛋白就表達(dá)水平不變(P0.05),第8周模型組蛋白表達(dá)低于對(duì)照組的蛋白表達(dá)(P0.05);隨著心衰的進(jìn)程發(fā)展,心衰模型組大鼠蛋白表達(dá)量逐漸下降(P0.05),到第10周、12周時(shí),蛋白表達(dá)沒(méi)有差異性(P0.05);對(duì)照組間穩(wěn)定表達(dá),沒(méi)有差異性(P0.05)。結(jié)論:1.采用腹主動(dòng)脈縮窄結(jié)扎可以很好地的復(fù)制大鼠高血壓致心衰模型,與文獻(xiàn)報(bào)道的相比,大鼠的成活率高,造模成功率也高。2.心衰模型組大鼠血壓呈規(guī)律變化,血壓在一定時(shí)間內(nèi)保持高壓,并在心衰嚴(yán)重期有一定的回落;心衰大鼠BNP表達(dá)水平隨心衰發(fā)生的嚴(yán)重程度逐漸升高。3.心衰發(fā)生后心肌細(xì)胞損傷,長(zhǎng)桿狀細(xì)胞減少。4.發(fā)生心衰的心肌細(xì)胞觀測(cè)到的鈣火花與正常的鈣火花相比,幅度大小降低、達(dá)峰時(shí)間及持續(xù)時(shí)間明顯延長(zhǎng),提示心肌細(xì)胞整個(gè)鈣循環(huán)功能受阻,包括鈣激發(fā)與鈣回?cái)z。5.鈣循環(huán)是心肌細(xì)胞保證收縮舒張功能的基礎(chǔ),心衰發(fā)生過(guò)程中,鈣釋放部位與興奮收縮耦聯(lián)相關(guān)的JP-2蛋白與及肌漿網(wǎng)鈣回?cái)z的SERCA2a蛋白均表現(xiàn)逐步下降,并且蛋白的變化在時(shí)間上與鈣火花發(fā)生變化時(shí)間相符,兩者發(fā)生變化具有相關(guān)性,提示多種機(jī)制發(fā)生造成心衰。
【學(xué)位單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R544.1;R-332;R541.6
【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
第1章 綜述
    參考文獻(xiàn)
第2章 實(shí)驗(yàn)研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 動(dòng)物分組
        2.2.2 CHF 模型制備
        2.2.3 大鼠尾動(dòng)脈壓監(jiān)測(cè)
        2.2.4 大鼠 CHF 發(fā)生的標(biāo)志物 BNP 檢測(cè)
        2.2.5 單個(gè)心室肌細(xì)胞的獲取
        2.2.6 Confocal 下鈣信號(hào)觀察
        2.2.7 獲得圖像的處理
        2.2.8 Western Blotting
        2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間取得的學(xué)術(shù)成果

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