發(fā)布時(shí)間：2020-10-24 00:53

　　 弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)，能感染幾乎所有恒溫動(dòng)物(包括人類)，引起弓形蟲(chóng)病，全世界近1／3的人口受到威脅。弓形蟲(chóng)是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊，造成隱性感染；但當(dāng)宿主免疫功能下降時(shí)(如腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，弓形蟲(chóng)可在宿主體內(nèi)播散引起弓形蟲(chóng)病甚至導(dǎo)致宿主死亡。婦女在妊娠期初次感染弓形蟲(chóng)可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，或引起胎兒先天性弓形蟲(chóng)病，表現(xiàn)為智力低下、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、失明等，這些癥狀可在胎兒出生時(shí)或是成長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)。弓形蟲(chóng)感染也是家畜／家禽流產(chǎn)、畸胎、死產(chǎn)的主要原因之一，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重。因此，弓形蟲(chóng)病的診斷，尤其是弓形蟲(chóng)現(xiàn)癥感染的及時(shí)診斷成為弓形蟲(chóng)病防治工作的重點(diǎn)。 目前，國(guó)內(nèi)外普遍采用免疫學(xué)方法檢測(cè)血清中的弓形蟲(chóng)IgG和IgM，所用抗原多是從感染動(dòng)物中收集或經(jīng)組織／細(xì)胞培養(yǎng)的弓形蟲(chóng)速殖子抗原。但這種制備速殖子抗原的方法昂貴費(fèi)時(shí)，純度低，試劑盒批間差異大，不易標(biāo)準(zhǔn)化。而在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)特異的目的蛋白，因蛋白產(chǎn)量高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉而被許多研究者選用。SAG1蛋白是弓形蟲(chóng)速殖子期特異性抗原，在不同蟲(chóng)株之間具有具有高度的保守性，大量實(shí)驗(yàn)證明SAG1蛋白具有良好的免疫原性，是弓形蟲(chóng)病診斷和疫苗研究的重要候選抗原分子。但SAG1蛋白是一個(gè)高度構(gòu)象依賴的蛋白，其空間結(jié)構(gòu)的形成主要依賴二硫鍵的正確連接。原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌)缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能，因此以往在大腸桿菌中獲得的重組 SAGI蛋白大都形成包涵體，表達(dá)產(chǎn)物由于錯(cuò)誤折疊而不具有特異的免 疫反應(yīng)性，需經(jīng)復(fù)雜的變性、復(fù)性過(guò)程才能恢復(fù)部分活性。本室陳曉光 等在大腸桿菌中以包涵體形式高效表達(dá)了SAGI蛋白的成熟片段(切除 了N末端的信號(hào)膚和C末端的疏水尾)，復(fù)性后可識(shí)別弓形蟲(chóng)感染血 清，但復(fù)性效率較低。 本研究嘗試在大腸桿菌中進(jìn)一步以可溶性形式表達(dá)成熟SAGI蛋白 片段，期待表達(dá)的重組蛋白無(wú)需復(fù)性即能具有良好的免疫活性，探討重 組蛋白作為新型診斷抗原的可能性;并且進(jìn)一步篩選針對(duì)重組SAGI蛋 白的單克隆抗體，探討單克隆抗體檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗原的價(jià)值，為建立一套 弓形蟲(chóng)感染的新型診斷體系打基礎(chǔ)。 目的:1.克隆SAGI基因截短片段，獲取以可溶性形式在大腸桿菌 中表達(dá)，具有特異免疫反應(yīng)活性的重組SAGI蛋白。 2.制備抗重組SAGI蛋白的單克隆抗體，進(jìn)行鑒定、純化， 為研發(fā)弓形蟲(chóng)Dipstick診斷試劑條打基礎(chǔ)。 方法:1.制備弓形蟲(chóng)速殖子特異的免疫兔血清。 2.利用限制性內(nèi)切酶從本室構(gòu)建的pET3Oa一SAGI中獲取 SAGI基因的截短片段，克隆到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET32a中，構(gòu)建表達(dá)型 重組質(zhì)粒pET32a一tSAGI，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。 3.優(yōu)化工程菌pET32a--tSAGI/BL21的表達(dá)條件，大量誘導(dǎo)表 達(dá)后對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。 4.用弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清檢測(cè)重組蛋白的免疫反應(yīng)性， 并用重組蛋白對(duì)人血清進(jìn)行檢測(cè)。 5.應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，將小鼠SPZ/0細(xì)胞與經(jīng)重組SAGI蛋白 免疫的小鼠脾細(xì)胞融合，篩選抗重組SAGI蛋白的單克隆抗體，并進(jìn)行 鑒定和純化。 結(jié)果:1.克隆了截短形式的SAGI基因，構(gòu)建了表達(dá)型重組質(zhì)粒 pET32a一tsAGI，測(cè)序結(jié)果顯示讀碼框架正確。 2.在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)了SAGI基因截短片段， 與弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清的Wester~blot結(jié)果顯示重組蛋白具有良 好的免疫反應(yīng)性。用重組SAGI蛋白檢測(cè)人血清，結(jié)果顯示該重組蛋白 在弓形蟲(chóng)病診斷方面具有良好的應(yīng)用前景。 一4- 3.篩選了五株針對(duì)重組SAGI蛋白的單克隆抗體，Western- blot結(jié)果顯示五株單克隆抗體與弓形蟲(chóng)速殖子SAGI抗原具有良好的免 疫反應(yīng)性，并且具有兩個(gè)不同表位。 結(jié)論:1.制備了高效價(jià)的弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清，已用于本室 表達(dá)的弓形蟲(chóng)重組蛋白的免疫活性鑒定。 2.在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)了SAGI基因的截短片 段，經(jīng)免疫反應(yīng)性鑒定和初步應(yīng)用試驗(yàn)，表明重組SAGI蛋白具有良好 的免疫反應(yīng)性和應(yīng)用前景。 3.制備了5株抗截短形式重組SAGI蛋白的單克隆抗體，經(jīng) 鑒定5株單抗均能識(shí)別天然SAGI蛋白，具有潛在的診斷價(jià)值。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

37KDa、34KDa、31KDa、ZsKDa、22KDa，與張艷等129]的結(jié)果基本一致。圖1一4兔血清與弓形蟲(chóng)速殖子抗原的Western一blot結(jié)果1:弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清;2:正常兔血清;3:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Fig.l一4Western一blotanalysisofrabbltseravstaehyzoiteantigenofT.go雌diilanel:rabbitseruminununizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii:laneZ:non刀alrabhitserum:lane3:Lowmoleeularweightmarker一24-

圖1一3弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清效價(jià)測(cè)定Fig.1一3Titereurvesofrabbitserellr莊nunizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii(三)弓形蟲(chóng)速殖子抗原與弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清的West娜一blot結(jié)果弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清與弓形蟲(chóng)速殖子進(jìn)行Westem一blot，DAB顯色后可見(jiàn)7條反應(yīng)區(qū)帶，主要區(qū)帶的相對(duì)分子量為55KDa、43KDa、37KDa、34KDa、31KDa、ZsKDa、22KDa，與張艷等129]的結(jié)果基本一致。圖1一4兔血清與弓形蟲(chóng)速殖子抗原的Western一blot結(jié)果1:弓形蟲(chóng)速殖子免疫兔血清;2:正常兔血清;3:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Fig.l一4Western一blotanalysisofrabbltseravstaehyzoiteantigenofT.go雌diilanel:rabbitseruminununizedwithtachyzoiteantigenofT.gondii:

重組質(zhì)粒經(jīng)上海聯(lián)合基因公司測(cè)序，插入子序列經(jīng)DNAMAN軟件與己發(fā)表的弓形蟲(chóng)RH株SAGI基因序列比較，同源性為99%。插入子序列在第9位由C突變?yōu)锳，在第288位由G突變?yōu)锳(見(jiàn)圖1一6)。第9位的突變是由于插入子序列在設(shè)計(jì)的時(shí)候?yàn)榱嗽黾右粋�(gè)Aflll酶切位點(diǎn)特異設(shè)計(jì)的無(wú)義突變，而第258位的突變懷疑為測(cè)序錯(cuò)誤。為進(jìn)一步證一25-
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范文平,賀爭(zhēng)鳴,衛(wèi)禮,鞏薇,吳惠英;分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理;1999年03期

2 吳翔,蔣立平,舒衡平,蔡力汀,張祖萍,沈杰;抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體免疫篩選弓形蟲(chóng)速殖子cDNA文庫(kù)[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2004年04期

3 王惠榕,嚴(yán)延生;抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體用于弓形蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)診斷的初步研究[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2000年08期

4 楊婷婷,嚴(yán)延生,王惠榕,何似,于恩庶;分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[J];海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1997年02期

5 陳彩華,傅翠娥,蔣柏鳴,范黎;分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;1985年04期

6 李永華,陳秀春,劉錦華,楊春貴,李新華;抗弓形蟲(chóng)主要表膜P30抗原單克隆抗體的制備與鑒定[J];泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2000年02期

7 王偉;關(guān)于弓形蟲(chóng)感染的免疫學(xué)研究及其在防治中的應(yīng)用前景[J];醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制;2000年08期

8 嚴(yán)華,童鯤,申厚風(fēng),張躍,陳俊華,諸葛末伊,單秋;制備單克隆抗體的一種新的免疫方法[J];免疫學(xué)雜志;1997年02期

9 李嘉榮,宋新英,徐志剛,陳天培;弓形蟲(chóng)抗體陽(yáng)性沙鼠的病理學(xué)觀察[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1998年02期

10 陳義忠,林建銀;弓形蟲(chóng)表面抗原P22蛋白的研究進(jìn)展[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;2005年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 唐琳;肝再生增強(qiáng)因子與肝癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2005年

2 侯桂華;巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在同種移植排斥中作用及其機(jī)理的研究[D];山東大學(xué);2004年

3 高勇;新型單克隆抗體熒光探針染料的合成及免疫熒光組織化學(xué)應(yīng)用[D];西北大學(xué);2006年

4 江敏;大鼠單克隆抗體的制備、鑒定、基因克隆、抗原分析以及藥物偶聯(lián)物的抗腫瘤作用研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1996年

5 秦迎松;人促血液血管細(xì)胞生成素（Haemangiopoietin, HAPO）單克隆抗體的制備、鑒定及應(yīng)用[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

6 萬(wàn)忠海;抗PEA單抗和單鏈抗體制備及在綠膿感染中的應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2008年

7 呂大偉;抗RANKL單克隆抗體在大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中的應(yīng)用及RANKL轉(zhuǎn)錄調(diào)控的探索性研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

8 莊國(guó)洪;抗DR4、DR5單克隆抗體誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株凋亡的研究[D];吉林大學(xué);2004年

9 付建芳;溶藻弧菌抗獨(dú)特型抗體基因工程疫苗的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 王曉潔;對(duì)蝦白斑癥病毒快速檢測(cè)試劑盒的研制及其應(yīng)用[D];中國(guó)海洋大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 言慧;具有特異免疫反應(yīng)活性的弓形蟲(chóng)重組SAG1抗原及其單克隆抗體的制備、鑒定和初步應(yīng)用[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 黃子逸;LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和單克隆抗體的研制及其對(duì)T細(xì)胞的共刺激效應(yīng)[D];蘇州大學(xué);2010年

3 李鐵民;抗P-選擇素單克隆抗體對(duì)大鼠胰腺缺血再灌注損傷的作用實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2003年

4 李曉龍;肝癌相關(guān)抗原SMP30 mRNA在癌細(xì)胞中的表達(dá)及其單克隆抗體的制備[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2010年

5 王妍;旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原單克隆抗體的制備及鑒定[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

6 鄭杰;分泌抗豬流感病毒（河南株）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的制備、鑒定和初步應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

7 邵煒慧;鹽酸克倫特羅單克隆抗體的研制及初步應(yīng)用[D];揚(yáng)州大學(xué);2005年

8 楊寧;納豆激酶的純化及其單克隆抗體的制備鑒定[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 唐琦;抗麻痹性貝毒素GTX2，3單克隆抗體的制備及特性分析[D];暨南大學(xué);2005年

10 賈娟娟;抗胰島素單克隆抗體的研制及酶聯(lián)免疫分析方法的建立[D];中國(guó)原子能科學(xué)研究院;2005年

本文編號(hào)：2853784