腫瘤是嚴重威脅人類健康的一類疾病，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因治療有望成為攻克腫瘤的突破口。在腫瘤患者重建有效的免疫應答及抑制腫瘤血管生成，是腫瘤治療的重要策略。研究表明，趨化因子不僅具有引導淋巴細胞定向遷移的功能，并能作為免疫調(diào)節(jié)因子，參與淋巴細胞的活化過程。趨化因子還能調(diào)節(jié)血管生成。在動物實驗中，趨化因子用于腫瘤治療已經(jīng)取得了顯著成效。4T1是BALB／c鼠源性乳腺癌細胞系，RT-PCR結(jié)果顯示，具有募集效應細胞及抑制血管生成作用的趨化因子IP10及ITAC在4T1細胞的表達水平較低。我們推測增強IP10或ITAC在4T1細胞的表達可能會影響4T1腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究以小鼠4T1乳腺癌為模型，觀察改變IP10或ITAC的表達對4T1腫瘤生長的影響及其機制。最后，根據(jù)趨化因子功能特點，將趨化因子作用顯著的結(jié)構(gòu)域組合起來，構(gòu)建了功能更顯著的抗腫瘤分子，可能為趨化因子用于腫瘤的生物學防治提供理論基礎和實驗依據(jù)。 1．IP10的抗腫瘤作用及其機制 我們構(gòu)建了pcDNA3-IP10真核表達質(zhì)粒。電穿孔的方法將質(zhì)粒導入4T1細胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株4T1-IP10。雌性BALB／c小鼠及裸鼠皮下接種4T1-IP10細胞后形成的腫瘤較對照組生長緩慢，腫瘤較小，重量較輕(P＜0.05)，并且4T1-IP10荷瘤小鼠存活時間明顯延長。實時定量PCR結(jié)果表明，在4T1-IP10腫瘤組織中IP10表達水平顯著上調(diào)。我們觀察了IP10對淋巴細胞在腫瘤局部浸潤的影響，結(jié)果表明，單位重量的4T1-IP10腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)量是對照組的兩倍；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞在4T1-IP10腫瘤內(nèi)浸潤顯著增加；FACS分析腫瘤浸潤淋巴細胞的表型，結(jié)果顯示，4T1-IP10腫瘤內(nèi)CXCR3~+CD4~+T和CXCR3~+CD8~+T細胞比例均較對照組增高。將4T1-IP10腫瘤浸潤淋巴細胞分離出來，體外經(jīng)特異性刺激后，增殖應答能力和特異性殺傷活性增強，腫瘤浸潤淋巴細胞IFN-γ分泌明顯增加。以上結(jié)果提示，募集并增強腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能在IP10介導的腫瘤生長抑制中具有重要的作用。我們進一步觀察了腫瘤局部IP10表達對機體細胞免疫應答的影響。體外特異性刺激后，4T1-IP10荷瘤小鼠的脾細胞抗原特異性增殖應答能力及殺傷活性均較對照組顯著增高(P＜0.05)。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者常見的死亡原因，誘導有效的細胞免疫應答是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的策略之一。實驗性肺轉(zhuǎn)移研究發(fā)現(xiàn)，與對照比較，接種4T1-IP10的小鼠，經(jīng)尾靜脈注射4T1細胞后，大體標本觀察發(fā)現(xiàn)，肺表面形成的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)顯著減少。4T1-IP10組小鼠肺重明顯減輕，肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)移的細胞形成的克隆顯著減少(P＜0.05)。肺組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，4T1-IP10組肺組織內(nèi)僅有小的單一轉(zhuǎn)移病灶，而對照組轉(zhuǎn)移灶較大并且可以形成多發(fā)的轉(zhuǎn)移病灶。 以往研究表明IP10具有抗血管生成的作用，因此，我們觀察了IP10抗血管效應在IP10介導的4T1腫瘤生長抑制中的作用。實驗結(jié)果表明，隨IP10濃度的增加，內(nèi)皮細胞增殖顯著受到抑制。劃痕實驗表明，IP10能抑制bFGF誘導的血管內(nèi)皮細胞遷移的80％。小鼠cornea micro-porket模型研究表明，IP10能顯著抑制bFGF誘導的血管生成。將血管內(nèi)皮細胞在4T1-IP10腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，結(jié)果顯示，4T1-IP10腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基能顯著延長血管內(nèi)皮細胞的生長周期，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖。腫瘤組織HE染色，光學顯微鏡下觀察，在4T1-IP10腫瘤局部可以看到血管閉塞現(xiàn)象及腫瘤局灶性壞死，而對照組血管密度高，并可以看到大的血管腔，提示IP10能通過抑制血管內(nèi)皮細胞生長，抗腫瘤血管生成，使腫瘤局部缺血壞死，發(fā)揮抗腫瘤作用。 2．ITAC的抗腫瘤作用及其機制 我們通過基因轉(zhuǎn)染的方法建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3-ITAC的4T1細胞(4T1-ITAC)。將4T1-ITAC細胞在小鼠皮下接種，觀察腫瘤生長狀況。結(jié)果顯示，在BALB／c小鼠及裸鼠體內(nèi)4T1-ITAC腫瘤生長較對照組緩慢，腫瘤較小并且重量較輕(P＜0.05)，荷瘤小鼠存活時間明顯延長。但是在裸鼠體內(nèi)4T1-ITAC生長抑制作用沒有在BALB／c小鼠體內(nèi)明顯。提示T細胞可能參與了ITAC介導的腫瘤生長抑制。實時定量PCR結(jié)果表明，在4T1-ITAC腫瘤組織中ITAC表達水平顯著上調(diào)。為分析ITAC在腫瘤局部表達對腫瘤淋巴細胞浸潤的影響，我們分離并計數(shù)了腫瘤浸潤淋巴細胞，結(jié)果顯示，單位重量的4T1-ITAC腫瘤內(nèi)分離的淋巴細胞數(shù)量顯著增加，是對照組的3倍。鑒于ITAC是CXCR3的配體，我們分析了CXCR3~+淋巴細胞在腫瘤內(nèi)的浸潤情況。FACS分析表明，CXCR3~+淋巴細胞比例在4T1-ITAC腫瘤顯著增高，并且在4T1-ITAC腫瘤內(nèi)CXCR3~+CD4~+T和CXCR3~+CD8~+T淋巴細胞比例均高于對照組。對于ITAC是否影響被趨化的淋巴細胞的效應功能尚未報道，因此，我們分析了在腫瘤局部表達的ITAC對腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4T1-ITAC腫瘤浸潤淋巴細胞，體外經(jīng)4T1特異性刺激后顯著增殖，殺傷活性較對照組明顯增強。ELISPOT檢測發(fā)現(xiàn)，4T1-ITAC腫瘤浸潤淋巴細胞IFN-γ分泌增加(P＜0.05)。這些結(jié)果表明ITAC能促進腫瘤淋巴細胞浸潤，并增強腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能，可能是ITAC介導腫瘤生長抑制的機制之一。為進一步確證ITAC的抗腫瘤效應，我們檢測了荷瘤小鼠的細胞免疫應答水平。結(jié)果顯示，4T1-ITAC荷瘤小鼠的脾細胞特異性增殖反應明顯增強，對4T1細胞的特異性殺傷活性增高(P＜0.05)。我們利用實驗性肺轉(zhuǎn)移模型檢測了4T1-ITAC荷瘤小鼠對4T1細胞在體內(nèi)播散轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果表明，接種4T1-ITAC腫瘤細胞的小鼠，其肺表面沒有明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)形成，肺重明顯減輕。肺組織轉(zhuǎn)移細胞克隆形成顯著減少(P＜0.05)。肺組織HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，4T1-ITAC組未見明顯的轉(zhuǎn)移病灶形成。這些結(jié)果提示ITAC在腫瘤局部表達能保護小鼠，降低腫瘤播散轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。 此外，我們檢測了ITAC的抗血管生成作用。劃痕實驗表明ITAC能抑制bFGF誘導的血管內(nèi)皮細胞遷移的55％。MTT法檢測，隨ITAC濃度的增加，對血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制效果不明顯。與4T1細胞培養(yǎng)上清比較，4T1-ITAC細胞的條件培養(yǎng)基能抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，但是與RPMI1640組比較沒有顯著差異。以上結(jié)果可能提示，ITAC具有一定的抗血管作用，并且參與了ITAC介導的腫瘤生長抑制，但不是主要的機制。 3．雙功能分子的設計及構(gòu)建 我們將先前的結(jié)果進行了統(tǒng)計學分析。與IP10比較，ITAC具有較強的趨化作用及誘導抗腫瘤細胞免疫應答的作用。與ITAC比較，IP10抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的作用更顯著。結(jié)構(gòu)功能分析表明，趨化因子的N端和N-LOOP區(qū)是結(jié)合及活化受體的關(guān)鍵部位，而趨化因子的C端可以結(jié)合在血管內(nèi)皮細胞表面，發(fā)揮抗血管生成的作用。結(jié)合以往文獻資料，我們設想ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端融合，構(gòu)建一個新型融合分子，具有ITAC和IP10分子的各自優(yōu)點，有望產(chǎn)生更顯著的抗腫瘤治療效果。我們首先對雙功能分子進行計算機模擬。將ITAC的N端和N-LOOP區(qū)與IP10的C端氨基酸序列輸入InsightⅡ工作站，模擬結(jié)果表明，兩個功能結(jié)構(gòu)域組合后能形成趨化因子樣穩(wěn)定的空間構(gòu)象，與IP10的氨基酸同源性達到66％，與已有的IP10的晶體衍射結(jié)構(gòu)相似，RMS值為1.08。我們將該分子命名為雙功能分—ITIP。我們通過PCR的方法擴增得到雙功能分子ITIP的全長編碼基因，構(gòu)建pcDNA3-ITIP質(zhì)粒，電穿孔法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4T1細胞并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株4T1-ITIP。RT-PCR結(jié)果表明僅在4T1-ITIP細胞中有ITIP的轉(zhuǎn)錄。趨化實驗表明，4T1-ITIP細胞上清對淋巴細胞具有顯著趨化活性，并能被CXCR3抗體特異性阻斷，并且ITIP趨化活性與ITAC沒有差異，但是較IP10增強。這些結(jié)果提示4T1-ITIP細胞能分泌具有活性的ITIP蛋白。 4．雙功能分子的抗腫瘤作用及其機制 我們以4T1乳腺癌為模型研究了ITIP的抗腫瘤作用。BALB／c小鼠皮下接種5×10~4 4T1-ITIP腫瘤細胞后，成瘤率為3／10，而4T1-IP10及4T1-ITAC的成瘤率分別為7／10和6／10，對照組小鼠全部有腫瘤生成。將1×10~5 4T1-ITIP細胞皮下接種裸鼠，結(jié)果4T1-ITIP腫瘤與4T1-IP10腫瘤生長較其余各組顯著減慢�？赡芴崾綢TIP具有抑制血管生成的作用，并且參與了ITIP的抗腫瘤效應。但是在裸鼠體內(nèi)4T1-ITIP腫瘤抑制作用沒有在BALB／c小鼠體內(nèi)明顯，提示T細胞可能也參與了ITIP介導的腫瘤生長抑制。 我們分析了ITIP在腫瘤局部表達對淋巴細胞浸潤的影響。FACS分析腫瘤浸潤淋巴細胞，結(jié)果顯示，CXCR3~+淋巴細胞在4T1-ITIP腫瘤內(nèi)顯著增加，并且CXCR3~+CD4~+和CXCR3~+CD8~+T淋巴細胞比例均高于對照組。我們進一步檢測了ITIP對腫瘤浸潤淋巴細胞的效應功能的影響。在荷瘤小鼠體內(nèi)被動轉(zhuǎn)移CFSE標記的淋巴細胞后，在4T1-ITIP腫瘤內(nèi)CFSE標記的淋巴細胞出現(xiàn)明顯的擴增。將腫瘤浸潤淋巴細胞在體外特異性刺激，4T1-ITIP腫瘤浸潤淋巴細胞特異性增殖應答能力及殺傷活性顯著增強，IFN-γ分泌明顯增加(P＜0.05)。我們還分析了4T1-ITIP荷瘤小鼠細胞免疫應答水平。4T1-ITIP荷瘤小鼠脾細胞在體外以4T1特異性刺激后，脾細胞特異性增殖反應顯著增強，對4T1靶細胞的殺傷活性明顯增高(P＜0.05)。ELISA檢測細胞因子分泌水平，結(jié)果表明，4T1-ITIP組小鼠脾細胞IFN-γ和TNF-α分泌顯著增加而IL-4分泌水平顯著降低。提示ITIP表達能增強機體細胞免疫應答水平，并向Th1型免疫應答偏移。 為觀察ITIP對血管內(nèi)皮細胞生長的影響，我們收集了4T1-ITIP細胞的培養(yǎng)上清，檢測4T1-ITIP細胞的培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮細胞生長動力學變化。結(jié)果顯示，在4T1-ITIP腫瘤細胞的條件培養(yǎng)基中，血管內(nèi)皮細胞的生長顯著受到抑制，提示4T1-ITIP能分泌具有抑制血管內(nèi)皮細胞生長活性的ITIP，發(fā)揮抗血管生成效應。 綜上所述，抑制腫瘤血管生成并誘導有效的抗腫瘤免疫應答，是IP10及ITAC抗腫瘤的重要機制。增強IP10(ITAC)分子與其受體CXCR3的相互作用將有利于腫瘤的治療。更重要的是，通過以上研究，我們發(fā)現(xiàn)ITAC具有更顯著的趨化淋巴細胞及誘導特異性免疫應答的作用，而IP10具有更明顯的抗血管生成的作用。我們將ITAC分子的N端和N-LOOP區(qū)及IP10的C端結(jié)構(gòu)域組合，構(gòu)建的雙功能分子ITIP產(chǎn)生了更有效的抗腫瘤作用。本研究為臨床制定抗腫瘤生物治療策略提供了實驗基礎，并為應用趨化因子進行腫瘤治療研究提供了新的思路。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2005
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

ITAC及雙功能分子誘導的抗腫瘤免疫及機制研究第一部分醇，一20℃放置30分鐘，10000rpm離心10分鐘，棄上清，將沉淀用70%洗一次，即得到純化的PCR產(chǎn)物。將純化的PcR產(chǎn)物6ul與pUCm一T載體用T4DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHS。，a一互補法篩選菌落，經(jīng)PCR及酶切鑒定IP10及工TAC插入pUClll--T后，以載體通用測序引上游引物分別與IP10及ITAC的上游及下游引物PCR鑒定插入片段的方向小。然后擴增陽性菌落，小量培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒工TAC一pUCmT和一pUCmT。再分別用EeoRV、BalnHI和EeoRI、Xhol雙酶切ITAC一pUCmT載體IO一pUCmT載體，將酶切片段用低熔點膠回收并純化。將酶切片斷與經(jīng)相應的pcDNA3連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHSQ，氨節(jié)青霉素篩選抗性菌經(jīng)PcR、酶切及測序鑒定證實成功構(gòu)建了pcDNA3一IP10和pcDNA3一ITAC真達質(zhì)粒。

ITAC及雙功能分子誘導的抗腫瘤免疫及機制研究第一部分結(jié)果1.趨化因子在4ri細胞系表達變化RT一PCR方法擴增16種趨化因子的基因編碼片段(圖1)，具有趨化效應細胞功能的MIP一2、MIP一la、BRAK、SDF一1及抑制血管生成的PF4、BCA一1及既具有抗血管生成作用又能趨化效應細胞的工P10和ITAC表達量較低。

LARC;lane16， BRAK;lane17，SDF一1.2.pcDNA3一IP10真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將RT一PCR法擴增到的34Obp的IP10基因編碼片段與peDNA3重組，如圖2所示，重組質(zhì)粒peDNA3一IP10經(jīng)pCR、反口尸了和肋01酶切及測序證明真核表達載體構(gòu)建成功。340bPCCCATGGGCGGCCG以汀GCAG人C(認GGTCTATAAGAATCCGGCCGCCAGGCATCCACTGTAACCACAGAAGGTAGCGTGGAG1，GTGCACGTGAC了叮人G人CAO幻妙汀人「l一fffC六TAGCCAAGTAG人ACAG窄叮AGATGT肖CGGACCTTCrAGAAAG口rTCTGCAGCCTGGTAATACGTGGCTGCATG丁C以AGACAGCAGAGGGTCAGJ門，CC丁GGC六CAGA口TCI，1.ATTGGAGGCTCA以CTCAGACGTTCCCAGGATGTCACATUI一l一王一fGACGC已汀人A兒認TT公1一l丁I一曰一工一CTATI，GCCrGCA們認TGAGGCGAGCI’ FGCrTGG人C了GGGGI.CC六GGCAC公I’l一r引，C萬1’1一工人TGAGCCTT口、TAGT人AC人ATAC門，C共ACI一廠fGI

【共引文獻】

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本文編號：2808548