【摘要】： N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDAR)是離子型興奮性氨基酸受體的一種類型，該受體具有生理學(xué)和病理學(xué)雙重作用，不僅與興奮性突觸傳遞、突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶等許多中樞活動密切相關(guān)，而且NMDAR過度激活所介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性在急、慢性神經(jīng)疾病、精神紊亂及神經(jīng)病性疼痛綜合征等病理狀態(tài)下起重要作用。通過選擇性干預(yù)NMDAR活動，可為相關(guān)致死、致殘性疾患提供有效的防治手段。然而，盡管目前NMDAR拮抗劑或阻斷劑多達數(shù)十種，但在臨床前期實驗中卻因嚴(yán)重的毒副作用和有限的臨床療效尚未能普遍投入使用。因此，人們開始探討新的抑制NMDAR功能的方法，興奮毒性損害免疫防治方法在該領(lǐng)域是一種新的探索。本課題組通過生物信息學(xué)方法對人NMDAR主亞基(NR1)上受體激活相關(guān)多肽片段的理化特性、抗原性及自身免疫原性等進行分析之后，確定NR1膜蛋白胞外區(qū)M3-M4環(huán)靶片段更易成為NMDAR免疫干預(yù)的分子靶點。以此為靶點采用免疫干預(yù)的方法來調(diào)控NMDAR的激活狀態(tài)，進而有望建立安全、可行的興奮毒性腦損害免疫防治的方法。人NR1膜蛋白M3-M4環(huán)靶片段是由163個氨基酸組成的多肽，相對分子質(zhì)量為18800，本研究采用基因工程方法獲得該肽段，以用于進一步免疫原性及相關(guān)應(yīng)用研究，為興奮毒性腦損害免疫干預(yù)提供實驗基礎(chǔ)。 一、腦膠質(zhì)瘤組織總RNA的提取 用Trizol試劑抽提新鮮腦膠質(zhì)瘤組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定RNA溶液260nm及280nm的讀數(shù)，以進行RNA定量及純度鑒定。 二、RT-PCR方法擴增目的基因 首先以總RNA的mRNA為模板，利用3′引物或其它下游引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；然后利用所合成的上、下游引物，采用PCR擴增出人NMDAR主亞基M3-M4 環(huán)的基因片段。 三、PCR引物的優(yōu)化改構(gòu) 為提高外源基因輸水平，按照計哪輔助原核表達載體PBV220中外源基因 高效表達的數(shù)學(xué)模型預(yù)測方法，優(yōu)化改構(gòu)洲PCR上游引物。其中 NA二級結(jié)構(gòu) 預(yù)測及局部密碼子們性計算分別由RNAfold軟件和Goldkey軟件完成，并保證改 構(gòu)后引物與原始引物具有相同的醇切位點。 四、原核表達臺體pBVJqRIL3的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切N EcoR和 BalnH！分別消化目的基因和表達質(zhì)粒 PBV220， 通過T4DNA連接酶進行連接，構(gòu)建表達質(zhì)粒PBVJqRIL3。用表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受 態(tài)大腸桿菌DH5a，通過酶切鑒定篩選陽性克隆，并以雙脫氧末端終止法對提取的 表達質(zhì)粒進行基因測序。 五、重組質(zhì)粒pBV－N’RIL3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達 升高培養(yǎng)溫度至 42℃誘導(dǎo)重組質(zhì)粒 PBV－NRI L3在大腸桿茵中的表達，取誘 導(dǎo)表達不同時刻菌體進行SDS－PAGE，以確定最佳誘導(dǎo)時間，并通過凝膠薄層掃 描分析，確定目的蛋自占菌體蛋自的百分含量。同時取表達量最高時刻的首液離 心收集茵體，冰浴超聲破碎，通過SDS－PAGE，觀察蛋自表達形式。 六、表達產(chǎn)物的純化 在制驗SDS－PAGE n上，電洗脫從膠片上切下的目的條帶，使用透析法 進行包涵體復(fù)性，通過冰干法，獲得純品粉末。 七、表達產(chǎn)物的鑒定 使用SDS－PAGE、Western印跡以及肽質(zhì)話指紋分析等方法從相對分子質(zhì)量、 免疫反應(yīng)性、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)等方面進行分析鑒定，最終確定表達蛋自即為目的 蛋白。 綜上所述，本研究以人腦膠質(zhì)瘤組織總RNA為模板，采用RT－PCR方法擴增 出人N’MDAR主亞基M3－M4環(huán)的基因片段，并成功構(gòu)建了原核表達載體 pBV柵l L3。同時，按照計算機輔助原核表達載體 pBV220中外源基因高效表達 的數(shù)學(xué)模型預(yù)測方法，將PCR引物進行優(yōu)化改構(gòu)，從而實現(xiàn)了目的基因的高效表 達，并對越產(chǎn)物進行了純化和鑒定。凝膠掃描分析表達量約占菌體總蛋白29％， 蛋自純度達95％以上。本研究解決了下一步研究所需的免疫原來源問題，為免疫 干預(yù)NMD見治療興奮毒性腦損害打下重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王麗;杜曉明;王林林;史西保;藤蔓;李功權(quán);權(quán)凱;郭軍慶;張改平;;人熱休克蛋白10和鼠熱休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表達[J];華北農(nóng)學(xué)報;2011年03期

2 盧璽宇;屈強;;N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)神經(jīng)突觸長時程增強的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年16期

3 尚游;顧佩菲;尚宇;李悅;;鹽酸戊乙奎醚(長托寧)抑制腦缺血/再灌注時谷氨酸的釋放及受體機制研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2011年03期

4 曲英敏;李艷艷;李景梅;王春鳳;;腦膜炎奈瑟氏菌NspA基因重組乳酸菌表達載體的構(gòu)建及原核表達[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2011年04期

5 陳超;盧永峰;劉慧瑩;宋立華;左庭婷;何君;檀華;朱虹;端青;;沙門菌屬pad蛋白的原核表達及抗原性的鑒定[J];軍事醫(yī)學(xué);2011年08期

6 陸靜芬;李芳秋;史利寧;王穎;;白念珠菌果糖二磷酸醛縮酶重組蛋白的制備及鑒定[J];臨床檢驗雜志;2011年05期

7 曾建明;劉飛;譚坪海;王麗娜;李沫;陳中華;李松;龍一飛;李有強;陳茶;;人CD96基因胞外區(qū)的原核表達及抗血清制備[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年07期

8 王曄;劉乃紅;王銳;楊小榮;李建國;張策;;大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡機制的研究[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2011年07期

9 王芳;何湘;趙江麗;姜錚;袁靜;黃留玉;;痢疾桿菌GST-IpaH4.5載體構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2011年08期

10 李楠楠;譚亮;王智平;王信超;廖智;;厚殼貽貝足絲黏附蛋白mfp-3重組表達及黏附功能分析[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2011年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 辛英豪;高繼明;劉標(biāo);李莎莎;姜世金;;Ⅰ型鴨病毒性肝炎VP1基因的克隆與原核表達[A];山東畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)專業(yè)委員會第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

2 焦石;賈立軍;薛書江;劉明明;黃國明;張守發(fā);;牛源犬新孢子蟲MAG1基因的克隆及原核表達[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第六次代表大會暨第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

3 彭躍躍;丁q

本文編號：2789876