【摘要】： 谷氨酸脫羧酶(GAD)是胰島B細胞的一種主要自身抗原，與1型糖尿病細胞免疫和體液免疫有密切關(guān)系，已廣泛應(yīng)用于臨床，作為糖尿病預(yù)測、診斷、分型、療效監(jiān)測的重要依據(jù)。 本研究首先用PCR方法，以pUC18/GAD_(65)為模板，擴增目的基因，克隆到pGEM-T載體中，構(gòu)建pGEM-T/GAD_(65)重組質(zhì)粒，然后用EcoRI酶切，切下的目的基因片段插入pET42a融合型表達載體中，經(jīng)酶切鑒定和測序，證實插入方向、讀碼框架正確；重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE_3)中誘導(dǎo)表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后獲得了融合蛋白GST-GAD_(65)。SDS-PAGE電泳和Western Blot分別鑒定融合蛋白大小和免疫活性后，對表達條件進行優(yōu)化，對包涵體進行分離、溶解和復(fù)性處理，以提高可溶性融合蛋白的產(chǎn)量，使融合蛋白達總蛋白的50％，相當(dāng)于1.495g/每升培養(yǎng)物。 我們利用原核表達系統(tǒng)成功克隆并表達了具有免疫活性的大鼠腦GAD_(65)基因，并對表達條件進行優(yōu)化，為今后基因工程大量生產(chǎn)應(yīng)用于糖尿病臨床檢驗和實驗研究的GAD蛋白打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：Q55

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