【摘要】：細(xì)菌性痢疾是一種全球性腸道的傳染病，至今仍威脅著人類健康和生命，引起該病的病原體為屬于革蘭氏陰性的志賀氏菌。我們國家所流行的細(xì)菌性痢疾主要是由志賀氏菌福氏2a引起的。志賀氏福氏菌是一種兼性胞內(nèi)細(xì)菌病原體，通過一種稱為病原體誘導(dǎo)的胞飲過程侵襲人結(jié)腸上皮細(xì)胞。位于志賀氏毒性大質(zhì)粒上的ipa(invasion plasmid antigen)操縱子對(duì)于編碼和分泌侵襲質(zhì)�？乖鞍资潜匦璧�，其編碼四種分泌蛋白IpaB，IpaC，IpaD和IpaA。在細(xì)菌與上皮細(xì)胞接觸時(shí)ida蛋白很快分泌出來，隨后IpaB和IpaC形成復(fù)合體，而該復(fù)合體為病原體進(jìn)入上皮細(xì)胞所絕對(duì)需要的。研究工作表明IpaC在痢疾的致病過程中起著非常重要的作用。為進(jìn)一步了解IpaC在痢疾致病過程中的分子機(jī)理，從宿主細(xì)胞中尋找與IpaC相互作用的蛋白則不失為一可取的研究策略。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在體內(nèi)研究蛋白相互作用的有效方法。因此我們應(yīng)用了酵母雙雜交系統(tǒng)研究宿主細(xì)胞中與侵襲蛋白IpaC相互作用的蛋白分子。類似的工作國內(nèi)外還未見報(bào)道。 本研究結(jié)合了分子生物學(xué)常規(guī)方法，酵母雙雜交技術(shù)和生物信息學(xué)等手段對(duì)與侵襲蛋白IpaC相互作的蛋白進(jìn)行了篩選和初步分析，有助與我們進(jìn)一步了解痢疾桿菌在致病過程中的分子機(jī)制，還為侵襲蛋白IpaC及其相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的思路，新方法。研究結(jié)果可概述為以下幾個(gè)方面： 1．通過PCR方法從野生型志賀氏菌福氏2a(2457T株)中克隆了侵襲蛋白ipaC基因，測(cè)序結(jié)果表明與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。 2．構(gòu)建痢疾桿菌侵襲蛋白IpaC誘餌蛋白載體pGBKT7-ipaC并轉(zhuǎn)化至酵母菌株AH109，Westem-blotting結(jié)果表明侵襲蛋白IpaC能在AH109中穩(wěn)定表達(dá)。并對(duì)IpaC自身的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明IpaC自
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖1蛋白X與Y不相互作用則報(bào)告基因不表達(dá)如果這兩個(gè)蛋白不相互作用，則帶有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的GAL4AD一就無法停留在激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子處，因此報(bào)告基因不表達(dá)，見圖1。相反，如果這兩個(gè)蛋白相互作用，則帶有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的GAL4AD守就停留在激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子處，同時(shí)使NRA聚合酶也靠近到啟動(dòng)子附近，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)，見圖2。Figure2AevtiationofthereP0rtergene1l

輪競(jìng)厥暇潿Pac基因的克隆及雙雜交誘餌蛋白載體的構(gòu)建對(duì)上述酶切鑒定正確的克隆進(jìn)行基因序列測(cè)定，結(jié)果見圖1一4。Figurel一SequeneeofPiaCgene圖1礴PiaC基因序列測(cè)定圖通過上下游測(cè)序和一個(gè)wal拓血g，經(jīng)拼接我們得到了Piac基因的全長序列。將得到的序列和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較(結(jié)果未顯示)，表明我們克隆的PiaC基因完全正確。

3、誘餌蛋白pGBKT7一Piac的構(gòu)建及鑒定質(zhì)粒pMDT.iPaC經(jīng)Nc口I和asll雙酶切，回收目的片段，與質(zhì)粒pGBKT7經(jīng)Nc口I和asll雙酶切后，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(見圖1一5)。Fgiurel一5SehematierPeresentationofeonsrtuetionofercombniantPlas面dxePressnigPIaC圖1一5誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7一ipac的構(gòu)建過程目的基因片段與pGBKT7載體連接后，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，Ncol和Sall雙酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)基因片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明誘餌蛋白載體構(gòu)建成功(見圖1一6)，將該陽性重組子命名為pGBKT7一PiaC。測(cè)序結(jié)果表明PiaC基因與pGBKT7載體中GAL4的DNA

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2786354