【摘要】： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染呈全球性分布。發(fā)達國家成人的感染率約30～50％，發(fā)展中國家則超過80％。大量研究資料證明Hp是人慢性胃炎和消化性潰瘍的特異性病原體，長期Hp感染與人胃癌和胃B細胞淋巴瘤的發(fā)生密切相關。目前臨床上用抗生素治療Hp的感染，但存在藥物副作用、費用較高、再次感染等問題。更為重要的是，長期使用抗生素可誘導Hp耐藥菌株產生，這給Hp再次感染時的抗生素治療帶來很大的困難。 接種疫苗所產生的人體特異性免疫力，具有穩(wěn)定和長期的特異性抗感染作用。已有一些文獻報告，Hp全菌裂解液可保護動物免受Hp感染，具有預防作用；也能清除動物體內已感染的Hp，從而具有治療作用。幾種Hp重組蛋白抗原在動物模型中已被證實能誘發(fā)保護性免疫反應，還可清除動物體內已感染的Hp。因此，Hp疫苗的研制及其應用對于Hp感染的防治、相關疾病的控制具有極為重要的意義。由于培養(yǎng)Hp的營養(yǎng)要求高、生長周期長、產量低、易污染、菌種保存困難等原因，基因工程疫苗應是Hp疫苗研制的主要方向。 所有Hp菌株均含有尿素酶(urease)，該酶對于細菌在強酸環(huán)境中生存、粘附細胞等均有重要意義。由于Hp尿素酶具有細菌外膜中有分布、 浙江大學碩士學位論文 陳 益 高度保守、顆粒狀結構、大分子量和強免疫原性等特點，最早作為Hp疫 苗的侯選抗原。業(yè)己肯定，尿素酶的抗原性主要取決于 B亞單位（UreB）。 早期的文獻根據(jù)是否含有細胞毒性相關蛋白（Cytotokic associated protein， C渺）和細胞空泡毒素（vacuolatin Cytoxin protein． vacA）將Hp菌株分 為 agAhacA＋和 cagA－／vaCA－兩類，并認為 cagA＋／vacA＋菌株有致病性， 呻－／vacA壩否。從亞洲國家人群分離的Hp菌株中，約75％的菌株為 cagA＋／vacA七因此，CagA和VacA可能是HP疫苗良好的侯選抗原。然 而，不少研究結果證實C渺基因變異很大，其產物C哪不宜作為疫苗的 抗原。vacA基因非常保守，不同 Hp菌株的 vacA基因核苦酸序列的同源 性高達90％以上，氨基酸序列同源性更高。此外，VaCA也具有細菌外膜中 有分布、大分子量和強免疫原性的優(yōu)點。因此UreB和VaCA應是較為理想 的Hp疫苗抗原。 本文擬克隆 Hp的 ureB和 vacA基因并構建表達系統(tǒng)，其產物將作為 Hp基因工程疫苗的抗原，為 Hp基因工程疫苗的研制奠定基礎。 實驗方法 1．Hp的分離培養(yǎng) 采集 26例患者胃粘膜標本，勻漿后涂布于含 10％抗凝羊血和抗生素添 加劑的Hp選擇性培養(yǎng)基上，微需氧環(huán)境中37’C培養(yǎng)扣。若菌落細小、半 透明，菌體革蘭染色陰性、呈弧狀或“海鷗”狀，快速尿素試驗陽性，能 與Hp抗血清凝集者為Hp。 2．Hp DNA的制備 采用常規(guī)酚－氯仿法、無DNse的RNase消化提取及純化Hp基因組 DNA。 3．＊C丑 2 浙江大學碩士學位論文 陳 品 ureB基因的擴增：反應體積 50…，內含 lpmol／L引物、5 mol幾 dNTP、40 mol／L MgCI。、2．SU Taq酶、IX PCR緩沖液及 100ng 模板。 PCR反應參數(shù)：94’C sinifi，ICyCle：94℃30SCC，58℃30SeC，68℃ 90秒，3o Cydes；72℃7mh，2。ydes。ureB擴增引物如下：上游 5’．GGAGAATTCATTAGCAGAAAAGAAMGTTTCT ATG－3’，下游 5’．GThCTCGAGC17ACGAAWCT777’GTTGCTTGACC．3’。 vacA基因的擴增：反應體積5口…，內含1卜mol幾引物、5 mol幾 dNTP、40 mol／L MgCI。、二．SU Taq酶、IX PCR緩沖液及 100ng 模 板。＊＊R反應參數(shù)：94℃sin h，1。y。ie：94℃30s＊。，58℃30s＊c， 68’C90秒，30 cycles；72oC 7min，2 cycles。vacA擴增引物如下： 上游5’－GCGGAATTCATGGAAATACAACAAACACAC－3’，下游 5’．GGGCTCGAGAThGGTACCTGTAGAAACAT．3’。 4．TA克醫(yī)、測序與表達載體的構建 用QIAqllick柱回收法純化回收PCR目的片段，與pGEM1Easy載體 連接形成pGEM�。鋫�acA和pGEM＊衛(wèi)asyureB重組質粒。陽性菌落 克隆經(jīng)酶切鑒定后，用雙脫氧鏈末端終止法測定插入片段的核昔酸序列。 所獲得的序列與 GeneBank登錄的 Hp ureB和 vacA序列進行核昔酸和氨基 酸同源性比較。 原核表達載體 pGEX上 q 的構建：EOOR和 wl雙酶切 pGEM－T－Easy vacA和原核表達載體pGEX6 l質粒DNA
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：Q78

【參考文獻】

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1 宋曉巖;幽門螺桿菌感染的流行病學研究進展[J];國外醫(yī)學(流行病學傳染病學分冊);1996年01期

2 史彤,劉文忠,蕭樹東,徐蔚文;上海地區(qū)幽門螺桿菌對抗生素耐藥率的變遷[J];中華內科雜志;2000年08期

本文編號：2781887