【摘要】：目的:白介素-10(IL-10)是一個對大多數(shù)造血細胞系發(fā)揮多向作用的多功能細胞因子。IL-10具有限制和終止炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的功能。克隆化人IL-10基因及重組蛋白的制備為研究HI-10基因表達在小兒炎癥性、過敏性疾病中的作用,治療性臨床應(yīng)用等提供堅實的基礎(chǔ)。 方法:采用過敏癥病人發(fā)作時期的外周血,在外周血單核細胞較高水平表達IL-10的時期,分離全血單個核細胞,提取總RNA。以總RNA為模板,根據(jù)人IL-10在GenBank中的全長開放讀框設(shè)計的特異性引物進行反轉(zhuǎn)錄,RT-PCR進行IL-10基因篩選。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切分析和DNA序列測定后;構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA4/HisMax-IL10,能夠較高效率地在哺乳類動物細胞中進行表達,可用于非病毒載體轉(zhuǎn)基因的實驗研究。 利用分子雜交技術(shù),將克隆化的IL-10基因通過亞克隆技術(shù)構(gòu)建了pTrehHis2B-hlL10原核高效表達載體,通過工程菌JM109經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組hIL-10蛋白,并經(jīng)與Ni-NTA樹脂中的6×His配體結(jié)合進行親和層析純化,表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分析。 結(jié)果:RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶切分析和DNA測序,克隆化人IL-10全長開放讀框完整,序列準(zhǔn)確無誤。酶切分析和DNA測序顯示外源基因在重組載體中的插入方向正確,表達讀碼框正確。SDS-PAGE分析顯示;原核表達系統(tǒng)表達的重組蛋白量和純度滿意。 結(jié)論:采用以總RNA為模板的RT-PCR一步法,能簡便、可靠地獲得hIL-10基因產(chǎn)物,所構(gòu)建的原核表達載體pTrcHis2B-hIL10,能夠快速、高效制備rhIL-10蛋白,為細胞因子hIL-10功能的進一步研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R392
【圖文】：

瓊脂糖凝膠rRNA，顯示顯降解見圖D28=0.0892/密度值為:18A在林g/林圖1.1組織中提取總RNA瓊脂糖電泳結(jié).果:1，2.QIAamp試劑盒提取總RNA電泳結(jié)果;185，285rRNA條帶清晰。為模板，Rl飛PCR一步法擴增，產(chǎn)物經(jīng)電GenBaz永中的扣丑NA序列，大小約550R圖LZRT一PCR一

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李曉琪;榮昌豬、內(nèi)江豬白細胞介素-10基因的克隆與原核表達研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號：2777150