發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 19:30

【摘要】： 呼吸窘迫綜合征是一種嚴(yán)重危害人類健康的原發(fā)性或繼發(fā)性疾病， 主要病因是肺表面活性物質(zhì)（PS）的缺乏或者功能不足。PS替代治療是唯 一有效的治療手段，目前臨床所使用的PS主要為動物肺組織和人羊水提 取物，但是制備比較困難，產(chǎn)品價(jià)格昂貴，不能滿足臨床的迫切需要， 因此人工合成磷脂和肺表面活性相關(guān)蛋白質(zhì)基因工程產(chǎn)物生產(chǎn)PS將是 獲得大量PS的理想途徑。肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）在調(diào)節(jié)磷脂 代謝、調(diào)控其它相關(guān)蛋白質(zhì)基因表達(dá)、發(fā)揮內(nèi)在免疫方面具有極其重要 的功能。人SP-A基因定位于染色體10q21-24，由兩個(gè)功能基因SP-A1、 SP-A2和一個(gè)假基因組成，兩種基因產(chǎn)物有97％的同源性。人SP- A（hSP-A）屬糖結(jié)合蛋白家族，主要由Ⅱ型上皮細(xì)胞合成。SP-A單體由248 氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約26～38kDa。本研究將正常中國人SP-A1 基因克隆至多種表達(dá)系統(tǒng)并獲得高效表達(dá)。 將hSP-A1基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-2T，轉(zhuǎn)化至E.coli JM101、JM105、JM109、XL1-blue和BL21（DE3）等不同宿主中表達(dá)，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白質(zhì)GST/SP-A1的表達(dá)量為6-15％，于28℃時(shí)，該 基因在BL21（DE3）宿主中表達(dá)產(chǎn)物均為完整蛋白質(zhì)（52kDa），表達(dá)產(chǎn)物占 總蛋白質(zhì)10％，而其它宿主中均有不完全蛋白質(zhì)（41kDa）表達(dá)。經(jīng)包涵 體純化和GST-Purification Kit純化得到52kDa的融合蛋白質(zhì)，純度為 95％，Thrombin酶切后可得到26kDa的SP-A1，兩者均能被抗-SP-A 的多克隆抗體識別，具有較好的免疫反應(yīng)性。GST/SP-A1免疫兔和小鼠 獲得的多克隆抗體能識別天然的SP-A。 重組pVT105U/α-SP-A1轉(zhuǎn)化Saccharomyces cerevisiae S-78， 在酵母普通培養(yǎng)基及營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基中表達(dá)出相對分子質(zhì)量分別 為62kDa和32kDa的蛋白質(zhì)，表達(dá)量約200mg/L，經(jīng)Sephadex G-25 層析柱分批脫鹽和 Sepharose 4B層析，純度達(dá)到 95％，目的蛋白 質(zhì)可被兔抗人－SP－A多克隆抗體和鼠抗人－SP－A單克隆抗體特 異性識別，體外殺傷實(shí)驗(yàn)表明SP－AI 能增加肺巨噬細(xì)胞對E．COIi 的吞噬和清除功能。 將人SP－AI基因克隆至酵母分泌表達(dá)載體PPICg，轉(zhuǎn)化至甲醇 營養(yǎng)酵母 Pichia pastoris，得到大量表型是His”Mut“（A0xl＋A0xZ“） 的重組菌株和少量表型為 HIS”MSt’M－AOXZO的重組體，以甲醇 誘導(dǎo)AOXI 啟動子高效表達(dá)的SP－AI，表達(dá)量約為400mg／L，用Sephadex G－25層析脫鹽和Sepharose 4B層析得到相對分子質(zhì)量約32kDa的 目的蛋白質(zhì)，具有調(diào)理肺巨噬細(xì)胞對病原體的吞噬作用。 綜上所述，SP－AI在大腸桿菌、S。CChs。OWC。S C�！薄薄薄甋“” S－78、Pichia P。storis中獲得表達(dá)，酵母表達(dá)產(chǎn)物具有調(diào)理肺巨 噬細(xì)胞吞噬病原體的活性，后者的表達(dá)產(chǎn)物活性更高，且可高密度 發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姬毅,封志純,黃建生,任大明;人肺表面活性物質(zhì)結(jié)合蛋白A基因組克隆及亞克隆[J];中國兒童保健雜志;2000年01期

本文編號：2776906