發(fā)布時(shí)間：2020-07-29 12:18

【摘要】： MBL系C型凝集素超家族中膠凝素家族的重要成員，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子。它可識(shí)別多種病原體的糖結(jié)構(gòu)，并通過調(diào)理吞噬和激活補(bǔ)體凝集素途徑來清除病原微生物和受感染細(xì)胞。MBL功能的發(fā)揮有賴于其寡聚體結(jié)構(gòu)和一定的血清濃度，血清中MBL缺乏或濃度過低是引起調(diào)理吞噬缺損的根本原因，使機(jī)體對(duì)各種病原微生物的易感性增高，可導(dǎo)致機(jī)體反復(fù)感染，并與自身免疫病如SLE、RA等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 MBL由肝細(xì)胞合成并分泌入血，其結(jié)構(gòu)基因點(diǎn)突變和啟動(dòng)子區(qū)SNP共同決定MBL的血清水平。結(jié)構(gòu)基因的每種變異體均由單堿基突變引起，致使MBL分子的膠原樣區(qū)發(fā)生改變，導(dǎo)致突變個(gè)體血清MBL水平低下，有可能突變MBL分子的功能也受損。MBL啟動(dòng)了區(qū)極其復(fù)雜，含外顯子0和多個(gè)調(diào)控序列，已發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)7個(gè)單堿基變異和1個(gè)六堿基缺失，其中對(duì)血清MBL水平影響較大的是H/L、X/Y和P/Q等3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別位于-550、-221和+4。不同的啟動(dòng)子基因型調(diào)控MBL基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的突變體，使得不同種族人群間，甚至同一種族不同個(gè)體間的MBL血清水平相差很大。 我國是一個(gè)多民族人口大國，有必要對(duì)各民族人群MBL基因的多態(tài)性情況進(jìn)行調(diào)查，以便為我國MBL缺損的防治研究提供決策依據(jù)。鑒于此，我們對(duì)漢族、佤族、白族、拉祜族及蒙古族普通人群MBL基因啟動(dòng)子區(qū)主要SNP位點(diǎn)進(jìn)行了等位基因及其單倍型與基因型的研究。 目的： 1．建立特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)MBL基因啟動(dòng)子區(qū)SNP的技術(shù)，并適于分析其單倍型與基因型。 2．利用該技術(shù)對(duì)漢族、佤族、白族、拉祜族及蒙古族普通人群MBL基因啟動(dòng)子區(qū)主要SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究，明確其等位基因、單倍型及其基因型的分布情況。 材料與方法： 1．收集漢族、佤族、白族、拉祜族及蒙古族普通人群血標(biāo)本，提取白細(xì)胞基因組DNA，并建立擴(kuò)增包含X/Y等位基因的目的基因片段的SSP-PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)MBL基因啟動(dòng)子區(qū)H/L和P/Q等位基因。 2.建立PCR一MB可視熒光檢測(cè)技術(shù)。 3.建立PCR一MB實(shí)時(shí)(real time)熒光檢測(cè)技術(shù)，分析分析漢族、低族、 白族、拉枯族及蒙古族人群MBL基因啟動(dòng)子區(qū)刀Y等位基因。 4.結(jié)合SSP一PCR和PCR一MB的檢測(cè)結(jié)果，確定MBL基因啟動(dòng)子區(qū)SNP 的單倍型、基因型及其頻率，分析各民族間分布的差異。 結(jié)果: 1.用紅細(xì)胞裂解液和PCR緩沖液/非離子去污劑/蛋白酶K兩種自配試劑 成功地提取了人白細(xì)胞基因組DNA，并以此為模板成功擴(kuò)增出預(yù)期目的基因 片段。 2.所建立SSP一PCR反應(yīng)體系實(shí)現(xiàn)了對(duì)等位基因曰L和P/Q的檢測(cè)，為單 倍型及基因型分析奠定了基礎(chǔ)。 3.建立了PCR一MB可視檢測(cè)技術(shù)，簡(jiǎn)便快捷、條件要求較低，達(dá)到了分 辨單堿基差異的特異性。 4.建立了PCR一MB實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，并分析了漢族、低族、白族、拉枯族 及蒙古族普通人群MBL基因啟動(dòng)子區(qū)習(xí)Y等位基因。 5.確定了各民族MBL基因啟動(dòng)子區(qū)主要SNP位點(diǎn)等位基因及其單倍型 與基因型的分布情況: (l)等位基因L用在5個(gè)民族間的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)， L等位基因在5個(gè)民族的總體分布均高于H等位基因;低族和白族L等位基因 頻率低于漢族、拉枯族和蒙古族。 (2)刃Y、P/Q等位基因在5個(gè)民族間的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p0.05)， 刀Y等位基因在5個(gè)民族均以Y等位基因?yàn)橹�，總體達(dá)89%;P/Q等位基因在 5個(gè)民族間的分布頻率較接近。 (3)各單倍型在5個(gè)民族間的分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(p0.01):漢族、 拉枯族以單倍型LYP、LYQ為主，低族以HYP、LYQ的頻率較高，而白族、 蒙古族以HYP、LYP、LYQ的頻率較高。 (4)各基因型在5個(gè)民族間分布的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01):漢族 以基因型LYP/LYQ、LxP幾YQ為主，侃族以LYP/LYQ、LYQ/LYQ、LXP/LYQ、 HYr/賈Q及HYP/H Yp的頻率較高，白族以LYp幾，YQ、LYQ/比Q、Lxp/LYQ 和HYP肛YP的頻率較高，拉枯族以LYP/LYQ、Lxp幾YQ及HYP/LYQ的頻率 較高，蒙古族以LYP/LYQ、LYQ/LYQ、LXPILYQ和HYP肚YP的頻率較高。 總體上，基因型LYP/LYQ和Lxp幾YQ在5個(gè)民族均具較高頻率，其總體分布 頻率分別達(dá)44.1%和16.6%。 結(jié)論: 1 .PCR一MB技術(shù)特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)單快捷，能進(jìn)行可視檢測(cè)，也能進(jìn)行高通 量、自動(dòng)化的實(shí)時(shí)分析，完全適用于點(diǎn)突變和SNP的研究，技術(shù)特點(diǎn)明顯優(yōu) 于PCR-SSCP、PCR一RFLP、PCR一550等傳統(tǒng)的點(diǎn)突變或SNP檢測(cè)方法。 2.聯(lián)用SSP一PCR和PCR一MB技術(shù)，有利于對(duì)功能基因的單倍型及基因型 的研究。 3.漢族、低族、白族、拉枯族及蒙古族普通人群之間，MBL基因啟動(dòng)子 區(qū)等位基因UH的分布存在差異，刀Y和P/Q無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異;各單倍型 和各基因型的分布存在差異;基因型LYP/LYQ和LXP/LYQ在5個(gè)民族均有較 高的分布，其總體頻率分別達(dá)44.1%及16.6%。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

圖6SSP一PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig·6AgarosegeleleetroPhoregramofSSP一PCRProduets3PcR-MB技術(shù)可視檢測(cè)X/Y等位基因.1PcR一MB可視檢測(cè)技術(shù)的MB的工作濃度在標(biāo)準(zhǔn)靶序列Tx、TY過量(l.0林mol幾)的情況下，雜交后，熒光顏著探針濃度的增高而加深，無靶序列時(shí)探針不發(fā)出熒光。探針MB一Y的工作濃度:試驗(yàn)中各管所含有效成分及雜交結(jié)果分別見表圖7。當(dāng)探針濃度達(dá)0.25林mol/L時(shí)，肉眼即可看到明顯的熒光

在M擴(kuò)十3.5~l/L條件下熒光信號(hào)增長(zhǎng)優(yōu)于M獷+2.ommol/L、1.smmol/L條件下的反應(yīng)。而在相同條件下僅含等位基因X的樣本與探針MB一Y結(jié)合行實(shí)時(shí)檢測(cè)則沒有明顯特征性信號(hào)增長(zhǎng)，見圖12B。而各反應(yīng)管PCR擴(kuò)增均成功，見圖13。用僅含等位基因X及Y的樣本分別與探針MB一X進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)也得到類似結(jié)果。腸拍.翻.勸.拍研:們翻壓壓壓即即}·}{}}}}}廠廠抓抓{{}}{{{盯盯{{}!{{{日日i}}{}}}朋朋曰曰不不不爪爪{日}}{{{尸尸廠廠{}{}}}}下下{:}{{}}}}廠廠}}{{{而而網(wǎng)網(wǎng)III}二二亞亞卜}}{}{{{廠廠獲獲}}}}}}}盯盯l}}l}}}尸尸川川爪]]]曰曰壓壓壓下下}}}川{{{日日仁仁一{川川叮叮1{}}}...「「叮叮刃刃門門叮叮叮盯盯1}}}}】】廠廠廠!{!}}}}盯盯}}1{{{{「「!口扣:::門門壓壓壓廠廠1}}}}{{{廠廠廠;日日日}{’1111廠廠:;;;;;門門廠廠廠盯盯}{}}{{{{廠廠廠洲(((卜卜}l}!{{{iii{{{廠!!!而而而爪爪{}{{){{{廠廠「「。{!{{{盯盯{」{{{{{};:::::「「曰曰甲甲甲而而!1}}{{{{廠廠月月}{{}}}}盯盯;}}川川{{{{{{抓抓「「四四莊莊二二l熱:::.1111日日〔二二)))目的的盼盼一日褂褂小斗斗砰砰閣閣陰陰陰)))貶貶份洲洲四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四四...............刃叮叮盯盯}}{}{{{}{;}}}「「門門{{{iii〔〔萬萬}!.}}!}{{{叮叮{洲洲脫脫;.}}}{{{{{;i}{!iii口口口口d.-護(hù)n，.﨑護(hù).﨏二日..J﨑，目，目-.刀，爪目

本文編號(hào)：2773954