【摘要】： 丙型肝炎病毒(HCV)感染呈全球性分布，目前全球感染率約3％，該病原�？梢鸪掷m(xù)感染，并且與肝硬化和肝細胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病。由于HCV體外培養(yǎng)尚未成功，至今仍無滿意的細胞和動物感染模型，極大地限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。 HCV感染致病機制尚未完全闡明。HCV為一單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒屬嗜肝病毒科，其基因組編碼的糖蛋白E1、E2構(gòu)成了其高度有序的表面結(jié)構(gòu)，其上可能存在與宿主細胞受體結(jié)合的配體表位。業(yè)已證明，病毒與細胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制過程中的始動環(huán)節(jié)，是決定病毒的宿主特異性、組織嗜性及致病性的主要因素之一。 Pileri等報道他們找到同E2結(jié)合的細胞表面分子，并經(jīng)測序證明為CD81，推測CD81是HCV的受體。因此，設(shè)想利用HCV受體或受體配體的模擬分子阻斷HCV入胞，可望為抗病毒治療提供新策略，并且可依據(jù)這種相互作用設(shè)計疫苗。 然而，目前國內(nèi)尚無較為完整的人CD81基因克隆及其與作為HCV受體的研究資料。為了進一步了解CD81在HCV感染中的作用，了解人CD81基因在不同種屬細胞株中表達狀況，探討建立受體介 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 導(dǎo)的細胞感染模的方法，本研究應(yīng)用分子生物學(xué)方法完成了以下 三方面的工作: 1.人CD81基因編碼區(qū)的克隆 根據(jù)已公布的人CDS IcDNA序列(核酸庫中的編號:NM- 004356)，設(shè)計一對引物，然后取傳代后的人Molt一4細胞，按照 產(chǎn)品操作說明書從人Molt一4細胞提取總RNA，運用RT一PcR及PcR 方法擴增出人CD81基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小 正確。 2.人CD81真核表達載體的構(gòu)建 應(yīng)用TA克隆方法將擴增出的基因片段插入pMD一18T載體， 進行基因序列測定;選取正確的人CD81基因分別定向克隆入真核 表達載體pVAXI及pcDNA3.1(+)，構(gòu)建兩種相應(yīng)的重組質(zhì)粒 pvAXI一CD81與pcDNA3.1一CD81，然后分別采用酶切及PcR方法進 行鑒定，確定其插入大小及方向。 3.人CD81分子在不同來源細胞中的表達 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，將pVAXI一cD81轉(zhuǎn)染至非洲綠猴腎細胞系 COS一7細胞，pcDNA3.1一CD81轉(zhuǎn)染至人肝癌細胞系H即仇細胞，采 用間接免疫熒光法(IFA)檢測CD81基因在COS一7細胞中的表達， 采用免疫組織化學(xué)方法(胡C法)及流式細胞技術(shù)(FACS)定性及 定量的檢測CD81基因在HepGZ細胞表達狀況。 結(jié)果: 1.成功地從人Molt一4細胞克隆了人CD81基因。 2.插入pMD一18T載體的CD81基因序列分析與與Genebank公布的 序列完全一致;成功構(gòu)建人cD81真核表達載體pvAxl一cD81與 pcDNA3.1一CD81，分別采用酶切及PCR鑒定，電泳可得到大小約 729bp的片斷。 3.重組質(zhì)粒pVAXI一CD81轉(zhuǎn)染COS一7細胞，IFA檢測發(fā)現(xiàn)COS一7 細胞表面能有效表達CD81分子。 第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 4.重組質(zhì)粒pcDNA3.l一CD81轉(zhuǎn)染至HepGZ細胞，結(jié)果表明人cD81 分子可在H即GZ細胞中有效表達，應(yīng)用流式細胞技術(shù)(FACS)檢測 到熒光強度為38.8%，明顯高于對照組。 結(jié)論: 1.本研究結(jié)果說明，應(yīng)用RT一CR方法可以從Molt一4細胞成功地 克隆人CD81基因，并用于受體重建的研究。 2.異種COS一7細胞和人H即G:細胞不表達人CD81分子，抗人CD81 單抗與猴CD81無交叉反應(yīng)，可作為HcV體外感染細胞模型的候選 細胞。可為證實CD81在HCV感染中的受體地位，進一步闡明HCV 感染細胞的機制提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R346

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本文編號：2762715