【摘要】： 研究背景與目的:病態(tài)竇房結(jié)綜合征(簡稱病竇綜合征)臨床常見,對人體健康危害極大,且發(fā)病機理不清,也無有效防治措施。目前,病竇綜合征的治療以植入電子心臟起搏器為首選,但電子心臟起搏器價格昂貴、電池壽命有限、需要定期檢測及更換,以及植入電子心臟起搏器可發(fā)生一些難以避免的并發(fā)癥,使其應(yīng)用受限。因此,探討對病竇綜合征患者竇房結(jié)結(jié)構(gòu)與功能進行修復(fù),重建一個具有正常生理功能的“生物心臟起搏器”,以取代電子心臟起搏器治療,則是當今心臟電生理學界研究的熱點之一。近年來,雖有少數(shù)將骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)直接或修飾后移植至生物體內(nèi)以構(gòu)建心臟起搏點的研究,但其結(jié)果尚不十分令人滿意,其主要問題是移植細胞在體內(nèi)存活時間短、心率增快不明顯及心率變異性低等,表明現(xiàn)有的“種子細胞”尚不能滿足構(gòu)建“生物心臟起搏器”的需要。因此,探索尋找適合構(gòu)建生物心臟起搏器的“種子細胞”,已成為當前心臟電生理學研究的重點內(nèi)容之一。 既往研究表明,起搏電流(funny current,If)是心臟竇房結(jié)細胞自律性產(chǎn)生與維持的決定因素,而超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(HCN)基因家族則是If形成的分子基礎(chǔ)。HCN基因家族包括四個成員,即HCN1～HCN4,其中HCN4與If的形成關(guān)系最為密切。為探討mHCN4基因修飾的大鼠MSCs作為構(gòu)建生物心臟起搏器“種子細胞”的可行性,本研究在國家自然科學基金(30370585)的資助下,利用本課題組在前期研究中構(gòu)建的mHCN4基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,對大鼠MSCs進行轉(zhuǎn)染,并在體外誘導(dǎo)培養(yǎng),以期獲得具有自律性的心臟起搏樣細胞,為構(gòu)建生物心臟起搏器提供“種子細胞”。 研究方法: 1.以mHCN4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)及不含mHCN4的逆轉(zhuǎn)錄病毒對照載體(pMSCV-EGFP)分別轉(zhuǎn)染大鼠MSCs,并進行嘌呤霉素加壓篩選,觀察綠熒光蛋白表達情況,并以免疫細胞化學檢測mHCN4基因表達,以全細胞膜片鉗技術(shù)對重組mHCN4通道進行動力學測定。 2.將獲得的mHCN4基因修飾大鼠MSCs進行體外誘導(dǎo)培養(yǎng),用倒置顯微鏡進行活細胞形態(tài)學的動態(tài)觀察。 3.用透射電鏡觀察誘導(dǎo)培養(yǎng)后細胞的超微結(jié)構(gòu),用免疫細胞化學法檢測細胞α-actin、cTnT及Cx43的表達,用膜片鉗技術(shù)記錄細胞的動作電位。 4.對轉(zhuǎn)染mHCN4基因的大鼠MSCs與分離的普通心房肌細胞進行混合培養(yǎng),用透射鏡電觀察細胞間結(jié)構(gòu)連接情況;用熒光光漂白后恢復(fù)技術(shù)(FRAP)檢測細胞間通訊功能狀況。 研究結(jié)果: 1.成功將mHCN4逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs,并經(jīng)加壓篩選獲得了穩(wěn)定表達mHCN4基因的大鼠MSCs。 2.對獲得的穩(wěn)定表達mHCN4基因的大鼠MSCs進行細胞膜片鉗檢測,可記錄到超極化激活的內(nèi)向電流,其半數(shù)最大激活電壓為-98.2±5.7mV,反轉(zhuǎn)電位是22.5±5.2mV,在-140mV指令電位時的激活時間常數(shù)為451±61ms。該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性,且對細胞外Cs+高度敏感。在相同記錄條件下,僅轉(zhuǎn)染pMSCV-EGFP的大鼠MSCs及未轉(zhuǎn)染組大鼠MSCs均未記錄到明確的超極化內(nèi)向電流。 3.對mHCN4基因修飾的大鼠MSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng),用倒置顯微鏡進行活細胞觀察發(fā)現(xiàn),普通培養(yǎng)10天左右,可觀察到搏動細胞出現(xiàn),細胞呈長桿狀,搏動頻率88-318次不等,平均202±72.9次/分,單個細胞自主搏動2-3天后停止,其收縮最明顯地部位出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)。隨后搏動細胞不斷出現(xiàn),呈集落生長,可觀察到短梭形、單細胞核細胞搏動。GFP組細胞僅見少量長桿狀細胞出現(xiàn),未觀察到細胞自主搏動,對照組細胞形態(tài)未見明顯變化及細胞的自主搏動。 4.選擇普通培養(yǎng)14天的搏動細胞,用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),該細胞可記錄到竇房結(jié)細胞樣的動作電位(平均最大舒張電位為-50.9±4.8mV,平均動作電位幅度為62.9±5.2mV); 5.搏動細胞經(jīng)免疫細胞化學檢測,該細胞不但表達mHCN4通道,同時表達心肌特異性蛋白α-actin及cTnT;透射電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)其細胞內(nèi)有明顯肌絲分布,但肌絲的排列紊亂與稀少,未見肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)形成,胞漿內(nèi)可見豐富的顆粒、少量線粒體,其結(jié)構(gòu)特點與乳鼠竇房結(jié)細胞超微結(jié)構(gòu)非常相似。 6.經(jīng)檢測mHCN4基因修飾大鼠MSCs可表達Cx43,其表達水平明顯較GFP組及未轉(zhuǎn)染組高,與心房肌細胞的Cx43表達水平無明顯差異。 7.透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)到mHCN4基因修飾大鼠MSCs可與相鄰細胞間可形成指狀交錯的連接,并可觀察到縫管連接的形成。. 8.經(jīng)熒光光漂白后恢復(fù)技術(shù)(FRAP)檢測發(fā)現(xiàn)mHCN4陽性細胞組及mHCN4陽性細胞與心房肌細胞共培養(yǎng)組的平均熒光恢復(fù)率明顯高于GFP陽性細胞組及GFP陽性細胞與心房肌細胞共培養(yǎng)組,并與心房肌細胞組相似。 本研究結(jié)論: 1.mHCN4可成功轉(zhuǎn)染至大鼠MSCs,并可穩(wěn)定持續(xù)的表達。 2.mHCN4基因修飾的大鼠MSCs可記錄到If,表明其已具有心臟起搏細胞的電生理特性。 3.mHCN4基因修飾大鼠MSCs可在體外誘導(dǎo)分化為具有自律性的心臟起搏樣細胞。 4.mHCN4基因修飾大鼠MSCs高度表達Cx43,并可與混合培養(yǎng)的心房肌細胞產(chǎn)生縫隙連接,并存在有效的胞間通訊。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R541.7;R329
【圖文】：

該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性，其在-140mV 指令電壓下的平均電流密度為-43.5±3.8pA/pF（圖1-1A），不同指令電壓下的電流密度詳見表 1-1。在相同的記錄條件下，GFP 組（見圖 1-1B）及對照組細胞未能檢測到明顯的超極化內(nèi)向電流。HCN4 組細胞的超極化激活內(nèi)向電流檢出率約為 80%（n=20）。HCN4 組細胞的平均膜電容為 74.8±14.6 pF（n=20），GFP 組及對照組平均膜電容分別為 73.6±13.8pF（n=19），74.2±13.7pF（n=19），各組間無明顯差異（P>0.05）。圖 1-1A HCN4 組細胞電流曲線及指令電壓方波

圖 1-1B GFP 組細胞電流曲線及指令電壓方波表 1-1 實驗組細胞在不同指令電壓（mV）下的 If電流密度（pA/pF n=10）指令電壓-140 -130 -120 -110 -100 -90 -80 -70 --43.5 -41.9 -39.1 -34.9 -31.1 -26.6 -14.2 -5.7 -度±3.8 ±3.7 ±3.2 ±3.2 ±3.2 ±2.8 ±2.3 ±1.2 ±2）細胞外 Cs+對通道電流的影響細胞外液加入 CsCl（4mMol/L）后，該超極化激活的內(nèi)向電流減小幅

圖 1-3 HCN4 組細胞 If尾電流及指令電壓方波表 1-2 HCN4 組細胞在不同指令電壓（mV）下的 If尾電流密度（pA/pF n=5）指令電壓-140 -130 -120 -110 -100 -90 -80 -70 流25.3 24.9 22.7 19.2 12.7 7.4 3.1 1.2 度 ±4.0 ±4.1 ±4.0 ±3.0 ±2.0 ±1.1 ±0.5 ±0.2 0.81.01.2pA/pF//pA/pFmax)

【參考文獻】

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1 朱淑霞,宋治遠,羅向東,仝識非,蘇踴躍,梁光萍,唐紅英;體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2005年15期

2 魯玲玲,蘇玉金,趙春禮,鄒西峰,侯少平,徐群淵,楊慧;骨髓基質(zhì)細胞的分離、鑒定以及TH基因的轉(zhuǎn)染與表達[J];生物化學與生物物理學報;2003年06期

3 任曉慶,浦介麟,張澍,賈玉和,趙欣然,孟亮,王方正;自體骨髓間葉干細胞誘導(dǎo)分化移植重建竇房結(jié)起搏功能的實驗研究[J];中國循環(huán)雜志;2004年06期

4 仝識非,宋治遠,鐘理;模擬缺血-再灌注對竇房結(jié)細胞起搏離子流的影響及K_(ATP)通道開放劑的干預(yù)作用[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2002年03期

5 李繼文;郭繼鴻;張萍;李春;劉元偉;周春燕;;起搏通道基因亞型HCN4重組腺病毒載體的構(gòu)建及通道電流檢測[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2006年01期

6 農(nóng)耀明;宋治遠;尹戴佳佳;陳鵬慧;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)一周后的細胞膜電流[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2006年04期

7 仝識非;宋治遠;姚青;萬瑛;鄒麗云;鐘理;;mHCN4基因修飾小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞重建起搏離子流通道[J];中國心臟起搏與心電生理雜志;2007年01期

8 張照,徐有秋;“缺血”對心室正常起搏活動影響的細胞電生理學研究(Ⅰ)[J];中華心律失常學雜志;2000年02期

9 徐有秋;I_f離子流和心臟起搏[J];中華心律失常學雜志;2001年04期

10 任曉慶;浦介麟;王方正;;干細胞移植與轉(zhuǎn)基因治療建立生物起搏器的實驗研究進展[J];中華心律失常學雜志;2006年02期

本文編號：2761683