【摘要】： 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，Kp)莢膜糖蛋白是一種免疫調(diào)節(jié)劑，國(guó)外已開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)藥必思添(Biostim)。本文在前人工作的基礎(chǔ)上對(duì)國(guó)內(nèi)臨床分離的肺炎克雷伯菌Kp-9株經(jīng)過細(xì)菌裂解、抽提、去脂、去除雜蛋白和有機(jī)溶劑沉淀獲得莢膜糖蛋白粗產(chǎn)品。經(jīng)多次重復(fù)上述提取過程表明該方法有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。 本文采用季銨鹽沉淀法對(duì)粗產(chǎn)品進(jìn)行部分純化，分離其中的中性糖蛋白和酸性糖蛋白，最佳分離方案為：pH=7.0，樣品濃度為1％，CTAB濃度為3％。對(duì)分離后的兩種成分進(jìn)行免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，表明活性成分存在于中性糖蛋白中。純度由粗產(chǎn)品的29.99％提高到53.75％。繼而采用制備型反相色譜法對(duì)粗產(chǎn)品和部分純化產(chǎn)品進(jìn)一步純化，其純度分別達(dá)到93.4％和96.3％。純品的保留時(shí)間為4.999分鐘，與必思添(保留時(shí)間5.001分鐘)非常接近，其蛋白含量為33.0％、總糖24.7％、葡萄糖醛酸4.1％，與必思添報(bào)道(蛋白質(zhì)30-45％，中性多糖30-40％，葡萄糖醛酸4％)基本一致，僅糖含量略偏低。本試驗(yàn)用高效液相色譜法測(cè)定了Kp莢膜糖蛋白的分子質(zhì)量。結(jié)果必思添的保留時(shí)間為13.5分鐘，分子質(zhì)量55036D；本文提取的Kp莢膜糖蛋白保留時(shí)間為12.86分鐘，分子質(zhì)量為60634D。兩者很接近，提示為同一物質(zhì)。 Kp莢膜糖蛋白粗產(chǎn)品免疫功能檢測(cè)采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)和溶血空斑試驗(yàn)，分別測(cè)定細(xì)胞免疫和體液免疫功能。結(jié)果4組劑量樣品對(duì)T細(xì)胞增殖均有不同程度的刺激作用，以20μg/ml組刺激作用最強(qiáng)。溶血空斑試驗(yàn)用20μg/只樣品免疫小鼠，結(jié)果試驗(yàn)組的抗體形成能力為25.667±2.965，顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，與必思添組(20μg/只)相當(dāng)(P＞0.05)。 人津廠科人學(xué)碩1：學(xué)位論文 本試驗(yàn)還觀察了即莢膜糖蛋白粗產(chǎn)品對(duì)小鼠細(xì)菌感染的保護(hù)作用。 Kp莢膜糖蛋白分為低劑量組（3mg／k體重）和高劑量組6 體重L 免疫小隊(duì)，結(jié)果大腸埃希菌組的高劑量組小鼠存活率為87．5％，與對(duì)照 組（存活率12＊％）相比P叩刀5：金黃色葡萄球菌組小鼠存活率低劑量 組為 87．5O，高劑量組為 100％，均顯著高于對(duì)照組（前者 P＜0．05，后者 P＜0刀1人接受即莢膜糖蛋白注射的動(dòng)物在觀察過程中均未發(fā)現(xiàn)不良反 應(yīng)。 細(xì)菌感染保護(hù)試驗(yàn)結(jié)束后，用ELISA法檢測(cè)小鼠循環(huán)抗體效價(jià)。結(jié) 果顯示大腸埃希菌組中低劑量組抗體平均效價(jià)為1：443，高劑量組為 1：508；金黃色葡萄球菌組兩者分別為1：408和1：487，與對(duì)照組（1：127〕 相比均有顯著性差異（P＜0刀1）。 本試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)篩選的莢膜糖蛋白產(chǎn)生菌Kpg株的實(shí)用效果，并 進(jìn)一步確定了實(shí)驗(yàn)室水平制備莢膜糖蛋白的工藝條件及其體內(nèi)外的免疫 調(diào)節(jié)作用，為新型日服免疫調(diào)劑必思添的國(guó)產(chǎn)化奠定了初步基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 郭堯君;SDS電泳技術(shù)的實(shí)驗(yàn)考慮及最新進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1991年01期

2 李曉霞,馮津津,李方濤,康寧,張瑛,陳錦英;肺炎克雷伯菌表面成分的免疫調(diào)節(jié)作用[J];天津醫(yī)藥;2001年04期

本文編號(hào)：2757831