【摘要】： 目的：柯薩奇B組病毒（CVB）,共有6個(gè)血清型（CVB1～CVB6），是人類病毒性心肌炎的主要病原體，目前尚無(wú)有效的病毒特異性防治措施來(lái)保護(hù)人類免受其危害。DNA疫苗的問(wèn)世，為建立有效的預(yù)防方法提供了機(jī)會(huì)。VP1是CVB3主要的衣殼蛋白，含有幾個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，抗原性強(qiáng)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，故其編碼基因成為CVB3 DNA疫苗最有希望的侯選基因。以VP1的DNA疫苗免疫小鼠后雖獲得較高的保護(hù)率，但中和抗體效價(jià)卻普遍偏低。其主要原因是DNA疫苗編碼的VP1蛋白可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)卻不能從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中自主釋放，因而不能有效激發(fā)抗體應(yīng)答。信號(hào)肽可以把合成的蛋白質(zhì)移向細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜結(jié)合，然后把合成的蛋白質(zhì)送出胞外；而且信號(hào)肽可在不同蛋白質(zhì)間互通使用。因此，在VP1基因的5′端融合上某種蛋白質(zhì)的信號(hào)肽基因可能會(huì)促進(jìn)表達(dá)的VP1蛋白從轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)分泌。人白細(xì)胞介素2（hIL-2）信號(hào)肽是由20個(gè)氨基酸組成的高度疏水性序列，在成熟hIL-2分泌過(guò)程中被信號(hào)肽酶切掉，切點(diǎn)在20位的Ser與21位的Ala之間。信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)與疏水性區(qū)域的長(zhǎng)度及切點(diǎn)下游的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究的目的就是將hIL-2信號(hào)肽及成熟hIL-2 N末端11個(gè)氨基酸殘基的基因與CVB3 VP1的cDNA融合，并克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3，構(gòu)建分泌型重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/sVP1； WP=4 免疫小鼠后，通過(guò)血清中和抗體效價(jià)及對(duì)致死量CVB3攻擊的保護(hù)作用評(píng)價(jià)其免疫效力。 方法：（1）采用重疊區(qū)基因擴(kuò)增法，將hIL-2信號(hào)肽及成熟hIL-2 N末端11個(gè)氨基酸殘基的基因（簡(jiǎn)稱hIL-2信號(hào)肽基因）與CVB3 VP1的cDNA拼接在一起，并大量擴(kuò)增。根據(jù)hIL-2基因序列及CVB3基因全序列設(shè)計(jì)并合成4條引物：hIL-2信號(hào)肽基因上游引物(primer 1)；hIL-2信號(hào)肽基因下游引物(primer 2)；VP1基因上游引物(primer 3)；VP1基因下游引物(primer 4)。primer 1和primer 4中分別引入HindⅢ和XhoⅠ的酶切識(shí)別序列；primer 2為搭橋引物，其5′端添加的18個(gè)堿基與VP1基因反意義鏈3′端堿基序列一致，故這18個(gè)堿基是hIL-2信號(hào)肽基因與VP1基因的重疊區(qū)。以pcDNA3/hIL-2為模板，用primer 1和primer 2擴(kuò)增hIL-2信號(hào)肽及成熟hIL-2 N末端11個(gè)氨基酸殘基的基因；從CVB3(Nancy株)的病毒液中提取病毒RNA，以primer 4為引物逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以primer 3和primer 4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增VP1基因；以hIL-2信號(hào)肽cDNA和CVB3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以primer 1和primer 4為引物進(jìn)行PCR，通過(guò)信號(hào)肽有意義鏈3′端與CVB3 RNA cDNA第一鏈的18個(gè)堿基的重疊區(qū)，將兩模板拼接在一起并在PCR過(guò)程中得以大量擴(kuò)增，獲得分泌型VP1(sVP1) 的cDNA。（2）將sVP1 cDNA克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建pGEM-T/sVP1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α，接種含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的2-YT瓊脂平板進(jìn)行篩選，用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定后測(cè)序。（3）用HindⅢ和XhoⅠ切割pGEM-T/sVP1，然 WP=5 后將切下的sVP1 cDNA亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3，構(gòu)建分泌型重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/sVP1；轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α后，接種抗生素（Amp）平板進(jìn)行篩選，用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。（4）用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的E.coli DH5α中大量提取分泌型重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/sVP1及對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3/VP1和pcDNA3，用聚乙二醇（PEG）沉淀法進(jìn)行純化。（5）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將4～6周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組20只；4組分別為生理鹽水對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組（pcDNA3組）、pcDNA3/VP1對(duì)照組及pcDNA3/sVP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100μg，每2周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，斷尾取血，分離血清，用微量中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）檢測(cè)血清中CVB3特異性中和抗體的效價(jià)。第3次免疫后2周，用1000TCID50 的CVB3腹腔內(nèi)攻擊，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天。 結(jié)果：（1）構(gòu)建了分泌型重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/sVP1，插入的sVP1 cDNA的長(zhǎng)度符合961bp的預(yù)期值，經(jīng)測(cè)序，證明與報(bào)導(dǎo)的CVB3 VP1基因序列、hIL-2信號(hào)肽基因序列及成熟IL-2 N端11個(gè)氨基酸的基因序列一致。（2）各次免疫后中和抗體的平均效價(jià)：pcDNA3/sVP1組分別為1:9.33, 1:24.62, 1:27.32； pcDNA3/VP1組為1:7.85, 1:9.01, 1:9.66； pcDNA3組及生理鹽水對(duì)照組各次免疫后中和抗體效價(jià)均小于1:5。對(duì)pcDNA3/sVP1第3次免疫后的平均中和抗體效價(jià)及pcDNA3/VP1第3次免疫后的平均中和抗體效價(jià)進(jìn)行成組設(shè)計(jì)兩樣本幾何均數(shù)比較的 WP=6 t檢驗(yàn)，P＜0.001，表明兩種質(zhì)粒的免疫效果有差別，pcDNA3/sVP1可比pcDNA3/VP1誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生更高水平的中和抗體。（3）用1000TCID50的CVB3攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：pcDNA3/sVP1組25%；pcDNA3/VP1組20%；pcDNA3組5%；生理鹽水組8%。pcDNA3/sVP1組21天生存率稍高于3個(gè)對(duì)照組，但經(jīng)行×列表資料的x2檢驗(yàn)，表明這種差異不顯著（0.25P0.5）；用log-rank檢驗(yàn)比較生理鹽水對(duì)照組與pcDNA3/sVP1組的生存曲線，及比較pcDNA3/VP1對(duì)照組與pcDNA3/sVP1組的生存曲線，均無(wú)顯著性差異（0.25＜P＜0.5）。 結(jié)論：（1）本研究成功地將VP1基因融合到hIL-2信號(hào)肽基因的3′端
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2757139