【摘要】： 目的：柯薩奇B組病毒（CVB）,共有6個血清型（CVB1～CVB6），是人類病毒性心肌炎的主要病原體，目前尚無有效的病毒特異性防治措施來保護人類免受其危害。DNA疫苗的問世，為建立有效的預防方法提供了機會。VP1是CVB3主要的衣殼蛋白，含有幾個T細胞和B細胞表位，抗原性強，可刺激機體產(chǎn)生保護性的中和抗體，故其編碼基因成為CVB3 DNA疫苗最有希望的侯選基因。以VP1的DNA疫苗免疫小鼠后雖獲得較高的保護率，但中和抗體效價卻普遍偏低。其主要原因是DNA疫苗編碼的VP1蛋白可在轉(zhuǎn)染細胞中表達卻不能從轉(zhuǎn)染細胞中自主釋放，因而不能有效激發(fā)抗體應答。信號肽可以把合成的蛋白質(zhì)移向細胞膜并與細胞膜結合，然后把合成的蛋白質(zhì)送出胞外；而且信號肽可在不同蛋白質(zhì)間互通使用。因此，在VP1基因的5′端融合上某種蛋白質(zhì)的信號肽基因可能會促進表達的VP1蛋白從轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)分泌。人白細胞介素2（hIL-2）信號肽是由20個氨基酸組成的高度疏水性序列，在成熟hIL-2分泌過程中被信號肽酶切掉，切點在20位的Ser與21位的Ala之間。信號肽酶切割位點與疏水性區(qū)域的長度及切點下游的二級結構有關。本研究的目的就是將hIL-2信號肽及成熟hIL-2 N末端11個氨基酸殘基的基因與CVB3 VP1的cDNA融合，并克隆至真核表達載體pcDNA3，構建分泌型重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3/sVP1； WP=4 免疫小鼠后，通過血清中和抗體效價及對致死量CVB3攻擊的保護作用評價其免疫效力。 方法：（1）采用重疊區(qū)基因擴增法，將hIL-2信號肽及成熟hIL-2 N末端11個氨基酸殘基的基因（簡稱hIL-2信號肽基因）與CVB3 VP1的cDNA拼接在一起，并大量擴增。根據(jù)hIL-2基因序列及CVB3基因全序列設計并合成4條引物：hIL-2信號肽基因上游引物(primer 1)；hIL-2信號肽基因下游引物(primer 2)；VP1基因上游引物(primer 3)；VP1基因下游引物(primer 4)。primer 1和primer 4中分別引入HindⅢ和XhoⅠ的酶切識別序列；primer 2為搭橋引物，其5′端添加的18個堿基與VP1基因反意義鏈3′端堿基序列一致，故這18個堿基是hIL-2信號肽基因與VP1基因的重疊區(qū)。以pcDNA3/hIL-2為模板，用primer 1和primer 2擴增hIL-2信號肽及成熟hIL-2 N末端11個氨基酸殘基的基因；從CVB3(Nancy株)的病毒液中提取病毒RNA，以primer 4為引物逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以primer 3和primer 4為引物進行PCR擴增VP1基因；以hIL-2信號肽cDNA和CVB3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以primer 1和primer 4為引物進行PCR，通過信號肽有意義鏈3′端與CVB3 RNA cDNA第一鏈的18個堿基的重疊區(qū)，將兩模板拼接在一起并在PCR過程中得以大量擴增，獲得分泌型VP1(sVP1) 的cDNA。（2）將sVP1 cDNA克隆至pGEM-T載體，構建pGEM-T/sVP1，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)DH5α，接種含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的2-YT瓊脂平板進行篩選，用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定后測序。（3）用HindⅢ和XhoⅠ切割pGEM-T/sVP1，然 WP=5 后將切下的sVP1 cDNA亞克隆至真核表達載體pcDNA3，構建分泌型重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3/sVP1；轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α后，接種抗生素（Amp）平板進行篩選，用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。（4）用堿裂解法從轉(zhuǎn)化的E.coli DH5α中大量提取分泌型重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3/sVP1及對照質(zhì)粒pcDNA3/VP1和pcDNA3，用聚乙二醇（PEG）沉淀法進行純化。（5）動物實驗：將4～6周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為4組，每組20只；4組分別為生理鹽水對照組、空質(zhì)粒對照組（pcDNA3組）、pcDNA3/VP1對照組及pcDNA3/sVP1組。純化后的質(zhì)粒以生理鹽水稀釋后，股四頭肌注射免疫小鼠，每次每只接種100μg，每2周免疫1次，共免疫3次；每次免疫后第14天，斷尾取血，分離血清，用微量中和試驗（固定病毒-稀釋血清法）檢測血清中CVB3特異性中和抗體的效價。第3次免疫后2周，用1000TCID50 的CVB3腹腔內(nèi)攻擊，觀察并記錄小鼠死亡情況至感染后第21天。 結果：（1）構建了分泌型重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3/sVP1，插入的sVP1 cDNA的長度符合961bp的預期值，經(jīng)測序，證明與報導的CVB3 VP1基因序列、hIL-2信號肽基因序列及成熟IL-2 N端11個氨基酸的基因序列一致。（2）各次免疫后中和抗體的平均效價：pcDNA3/sVP1組分別為1:9.33, 1:24.62, 1:27.32； pcDNA3/VP1組為1:7.85, 1:9.01, 1:9.66； pcDNA3組及生理鹽水對照組各次免疫后中和抗體效價均小于1:5。對pcDNA3/sVP1第3次免疫后的平均中和抗體效價及pcDNA3/VP1第3次免疫后的平均中和抗體效價進行成組設計兩樣本幾何均數(shù)比較的 WP=6 t檢驗，P＜0.001，表明兩種質(zhì)粒的免疫效果有差別，pcDNA3/sVP1可比pcDNA3/VP1誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生更高水平的中和抗體。（3）用1000TCID50的CVB3攻擊小鼠，各組21天生存率分別為：pcDNA3/sVP1組25%；pcDNA3/VP1組20%；pcDNA3組5%；生理鹽水組8%。pcDNA3/sVP1組21天生存率稍高于3個對照組，但經(jīng)行×列表資料的x2檢驗，表明這種差異不顯著（0.25P0.5）；用log-rank檢驗比較生理鹽水對照組與pcDNA3/sVP1組的生存曲線，及比較pcDNA3/VP1對照組與pcDNA3/sVP1組的生存曲線，均無顯著性差異（0.25＜P＜0.5）。 結論：（1）本研究成功地將VP1基因融合到hIL-2信號肽基因的3′端
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392

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本文編號：2757139