【摘要】： 目的：在成功的建立體外大鼠破骨細(xì)胞培養(yǎng)系的基礎(chǔ)上觀察不同濃度的阿侖磷酸鹽在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的情況，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以論證。 方法：實(shí)驗(yàn)分兩組：體外實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞培養(yǎng)組)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組)。 體外實(shí)驗(yàn)。全骨髓細(xì)胞的提取及培養(yǎng)：將4周齡雄性SD大鼠乙醚麻醉，斷頸處死。無(wú)菌條件下取股骨和脛骨，去凈骨表面的軟組織，剪斷長(zhǎng)骨兩骺端，暴露骨髓腔，用10ml一次性注射器吸取10miα-MEM插入髓腔沖洗，至骨發(fā)白。收集細(xì)胞懸液，然后以1500轉(zhuǎn)／分鐘離心4分鐘，棄去上清液，再加入40mlα-MEM吹打均勻后進(jìn)行二次離心。這樣洗滌細(xì)胞兩次后，加入20mlα-MEM全培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)15％新生牛血清，青霉素1000μ／ml，鏈霉素1000μg／ml)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，配成2×10~6cell／ml的細(xì)胞懸液，注入24孔培養(yǎng)板0.5ml／孔和50ml培養(yǎng)瓶10ml／瓶，同時(shí)加入1,25(OH)_2D_3使其終濃度為10~(-8)mol／l，然后放入5％CO_237℃孵育箱中培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)液，去掉3／5體積的舊培養(yǎng)液，換以同體積的含1,25(OH)_2D_3新培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第六天時(shí)，經(jīng)倒置相差顯微鏡和TRAP特異染色證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為破骨細(xì)胞。 培養(yǎng)板組和對(duì)照組：培養(yǎng)至第6天，加入ALN，使其終濃度為10~(-8)，10~(-7)，10~(-6)，10~(-5)M，對(duì)照組給予同體積的 中文摘要 磷酸緩沖液①BS），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后，平板離心 4分鐘，1500轉(zhuǎn)／分鐘，TRAP染色，鏡下計(jì)數(shù)每孔的破骨 細(xì)胞數(shù)目。再滴加 Hoechest33258染液，濃度為 5 u g／tl， 室溫下避光放置15分鐘，PBS緩沖液沖洗干凈，并用濾 紙吸干液體，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)和數(shù) 目。 培養(yǎng)瓶組和對(duì)照組：同上，培養(yǎng)至第6天時(shí)，加入同 板中濃度一致的ALN和同體積的PBS緩沖液，培養(yǎng)48 小時(shí)后，細(xì)胞刷輕刮瓶壁，洗滌兩次，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 用 Annexin－V和 PI結(jié)合檢測(cè)凋亡的破骨細(xì)胞數(shù)目。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。給藥：將3只大鼠隨機(jī)分成用藥組閃根 骨）和陰性對(duì)照組N根骨），按 Zing／kg ＃J量腹腔內(nèi)注射 ALN和 PBS連續(xù) 2日。 灌流固定及取骨：最后一次給藥24小時(shí)后，2％戊巴 比妥鈉腹腔內(nèi)注射，每只鼠注射0．4心石ml，36分鐘后， 待大鼠全身癱軟，進(jìn)入麻醉狀態(tài)，將其四肢固定，剪開胸 部皮膚及皮下組織，暴露心臟，用12號(hào)針從左心室直插 入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開左心耳，進(jìn)行心臟灌流。先以PBS 液將全身的血液沖出，然后注入固定液門．25％戊二醛，4％ 多聚甲醛，0．IM PBS液＊ 待大鼠全身僵直后，停止灌流。 按體外實(shí)驗(yàn)的方法取其股骨和腔骨，然后放入固定液中， 浸潤(rùn)固定2上小時(shí)。 脫鈣：將固定好的骨標(biāo)本用0．IM PBS液沖洗干凈，放 入PBS液中4oC冰箱過(guò)夜。第二日，將骨標(biāo)本放入PH＝7．4 的 5OEDM（ethylenediaminotetra acetic acid）中脫鈣 2周， 隔日換液一次。 2 中文摘要 制作骨切片：將脫好鈣的骨標(biāo)本常規(guī)梯度脫水，二甲 苯透明，浸蠟，包埋，然后將蠟塊切成spin厚的組織切 片備用。 TRAP染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。在常溫下，將 配好的htP染色液滴于切片上，每張3滴左右，然后放 入 5％COZ 37oC孵育箱孵育，30分鐘后取出，用蒸餾水沖 洗干凈。 蘇木素復(fù)染：將TRAP染好的切片放入蘇木素中5分 鐘，鹽酸－酒精分化后，二次脫水，二甲苯透明，樹膠封 片。 結(jié)果：l、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。IRAP染色結(jié)果：培養(yǎng)第 六天1’’vin染色，胞漿呈紫紅色且伸出許多細(xì)長(zhǎng)的偽足樣 突起，細(xì)胞核多者為破骨細(xì)胞。加藥后，對(duì)照組的陽(yáng)性細(xì) 胞數(shù)目明顯多于用藥組，且胞漿豐滿，內(nèi)含許多空泡結(jié)構(gòu)， 核仁清晰，核呈圓形或橢圓形，體積較大。而用藥組不僅 細(xì)胞數(shù)目少，且細(xì)胞多胞漿皺縮，TRAP染色極深，核固 縮，核仁結(jié)構(gòu)不清晰，但與正常的破骨細(xì)胞的體積大小近 似。這種形態(tài)學(xué)特征就是凋亡。相比較而言，二者在形態(tài) 上還是很好區(qū)分出來(lái)的。同時(shí)，用藥組與對(duì)照組均未見到 死亡的破骨細(xì)胞。 計(jì)數(shù)各組的破骨細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)為203．63土 2．92，明顯多于各用藥組（155．50士2．69，fis．50士2．29，93．88 土1．92，79．88土232），p＜0刀1有顯著性差異。且各用藥組間 除 10”’M和 10－’M之間無(wú)顯著性差異外，均有顯著性差異， 表明破骨細(xì)胞數(shù)目隨ALN的濃度增加而減少，兩者有劑 量依賴性。 3 中文摘要 Hoechest 33258熒光染色結(jié)果：Hoechest 33258是一 種活細(xì)胞染料，將顯微鏡調(diào)至WU段，在TRAP染色的 背景映襯
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R361

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本文編號(hào)：2745716