【摘要】： 機體的免疫應(yīng)答是一個十分復(fù)雜的過程，由多種免疫細胞和免疫分子(膜分子和可溶性分子)參與并受到嚴格的調(diào)控。近來的研究表明，一組細胞膜分子即共刺激分子(costimulatory molecules)的調(diào)節(jié)性表達、相互作用及其信號傳導(dǎo)在免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用，其中B7／CD28相互作用被認為是一個比較重要的信號傳導(dǎo)途徑。 編碼人B7-1(CD80)分子的基因位于2q33，所表達的蛋白分子量為44-54KD，為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員。B7分子以寡聚體形式表達于大部分抗原呈遞細胞(APC)表面，如活化的B細胞、T細胞、樹突狀細胞(DC)及IFN-γ活化的單核細胞中。一般認為，，CD28作為協(xié)同刺激分子的受體，通過與APC上B7分子的結(jié)合，起著傳遞信號，從而增強或放大免疫應(yīng)答的效應(yīng)；而CTLA-4負性調(diào)控T細胞的反應(yīng)性。B7-CD28／CTLA-4介導(dǎo)的共刺激信號在T細胞活化，輔助性T細胞分化及效應(yīng)性細胞因子分泌中起重要作用。通過增強共刺激信號，有利于腫瘤的排斥和腫瘤細胞的殺傷；而阻斷共刺激信號，則可誘導(dǎo)T細胞特異性免疫耐受的產(chǎn)生，有助于自身免疫性疾病或超敏反應(yīng)及異體移植排斥的防治。因此，研制抗人B7分子的功能性單克隆抗體并研究其生物學(xué)功能，具有重要的理論研究和應(yīng)用價值。 雜交瘤株的構(gòu)建：以人多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細胞轉(zhuǎn)入B7-1基因細胞株XG7-B7為免疫原，免疫BALB／C小鼠，采用B淋巴細胞雜 巨抗人87·l分子功能性單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究 中文摘要 交瘤技術(shù)，將免疫后小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行雜交，采 用聚乙二醇（polyythylene glycol，PEG）為融合劑，經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)，以小 鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)人B7－l基因細胞株L－B7為抗體篩選陽性細胞株，以轉(zhuǎn)基因 細胞的母本細胞幾）作為陰性對照細胞株，經(jīng)免疫熒光標記分析及抗體分 泌陽性孔內(nèi)細胞的反復(fù)篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得4株持續(xù)、穩(wěn) 定分泌鼠抗人 B7l（CD80）單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為 IFll、 3H8、6H2和7B10。經(jīng)快速定性試紙分析法鑒定，它們分泌的Ig類別分別為 lgGI門 門、6H2、7B10）和lgM門H8）。經(jīng)體外長期傳代培養(yǎng)和液氮凍 存后復(fù)蘇，雜交瘤細胞生長良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。 InAb的生產(chǎn)及純化：采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成 的陽性率為 90％，腹水的產(chǎn)量平均為 75 ml／只小鼠。經(jīng) ProteinG親和層析 法和優(yōu)球蛋白沉淀法獲得純化抗體。腹水型IYLAb經(jīng)純化后，單抗蛋白含量在 0石司刀mg／ml之間。免疫熒光法分析表明，腹水型單抗的效價為 1：1000以 上，純化后抗體蛋白用于間接兔疫熒光分析的用量為 0．25－2刀 v g6 X 10’細 胞。 為了研究單克隆抗體對B7－l 分子表達細胞的識別和結(jié)合，選擇表達 B7刁膜分子的惡性淋巴瘤細胞株Ran、EBV轉(zhuǎn)化的人B淋巴母細胞株、體外 誘導(dǎo)的DC 和人扁桃體來源的淋巴細胞作為陽性表達細胞與單克隆抗體反 應(yīng)，并以人T淋巴白血病細胞株Jurkat以及人外周血T細胞作為陰性對照。 經(jīng)間接免疫熒光標記分析，結(jié)果顯示，4株單克隆抗體均能識別不同細胞表 達的B7．1分子。 在與法國 Immunotech公司鼠抗人 B7＊ 克隆號 1976）的竟爭 抑制實驗中，IFll、6H2和 7B不能完全阻斷陽性對照 mAb與相應(yīng)抗原的 結(jié)合，提示該3株單抗與陽性對照ab識別不同的抗原位點。采用氯氨T 法將’‘’I標記單克隆抗體，通過’HI標記單抗與未標記單抗的配對競爭抑制 法分析表明，IFll與 6H2、7B所識別的抗原位點不同，6H2與 7＊ 0所識 別的抗原位點相同或相近。在此基礎(chǔ)上開展了用于檢測SCD80抗原試劑盒的 研制工作，并初步建立了 SCD80 ELISA檢測方法，提示這些抗體可能具有潛 二I 鼠抗人B7．l分于功能性單克隆抗體的研制及其主物學(xué)特性的研究 中文摘要 在的臨床應(yīng)用價值。 在中和／阻斷試驗中，以XG7書7為刺激細胞，人外周血T淋巴細胞為 反應(yīng)細胞，分析抗體對T細胞增殖的影響。經(jīng)3H1dR摻入法證實，IFll、 3H8和6H2均能不同程度地阻斷B7－1分子介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號，從而抑制 B7－1 轉(zhuǎn)基因細胞對人外周血T淋巴細胞的增殖激發(fā)效應(yīng)（抑制率在 21％一52％），提示這 3株單抗是阻斷型抗體，而 7B對 B7－1分子介導(dǎo)的協(xié) 同刺激信號沒有阻斷作用。 以天然表達B7q分子的人惡性淋巴瘤細胞株＊
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株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目4Chromosomeoffourhybridomacellsdeterminingmethodwasdeseribedinthematerialsandmethods.ThemosomenumberwasobservedunderaninvertedmieroseoPe.Theeellsorethanahundredehromosomes.ItshowedthattheIFll、3H8、6H2B10werethehybridomaeells.

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本文編號：2631171