【摘要】：目的對(duì)肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,Mp)3’端的P1黏附蛋白基因片段進(jìn)行基因克隆、重組表達(dá)、蛋白純化和表達(dá)產(chǎn)物的免疫性分析,為臨床診斷試劑和疫苗的研制打下基礎(chǔ)。方法應(yīng)用PCR技術(shù)直接從MpFH株染色體DNA中擴(kuò)增894bp的3’端p1基因片段(p1’),將此基因片段插入表達(dá)載體pGEX-6P-1后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增及核苷酸測(cè)序進(jìn)行鑒定。誘導(dǎo)陽性克隆株表達(dá)重組蛋白后純化,用兔抗Mp多克隆血清通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)鑒定其免疫反應(yīng)性。結(jié)果插入重組質(zhì)粒的p1基因片段經(jīng)測(cè)序后,與GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比較,其同源性為99.66%～100%。氨基酸序列同源性為99.32%～100%。經(jīng)SDS-PAGE分析,重組蛋白的相對(duì)分子量約為59kDa。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組蛋白是P1黏附蛋白抗原。結(jié)論成功構(gòu)建了pGEX-6P-1-p1’重組質(zhì)粒并獲得表達(dá)。此p1’基因重組質(zhì)粒表達(dá)的蛋白具有免疫反應(yīng)性,有希望成為特異性抗原診斷試劑和疫苗的候選抗原。
【圖文】：

體DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增的p1’基因長(zhǎng)度為894bp,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,與預(yù)期長(zhǎng)度一致,擴(kuò)增濃度和特異性好。結(jié)果見圖1。圖1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products1:DNA Marker DL2000;2.bland control;3:PCR prod-uct ofMpp1 gene2·2　表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定　以重組質(zhì)粒為模板,PCR可擴(kuò)增出單一條帶,片段長(zhǎng)度與預(yù)期長(zhǎng)度一致。重組質(zhì)粒用EcoRI酶、XhoI酶進(jìn)行雙酶切產(chǎn)生了4.9 kb和0.9 kb兩個(gè)片段。用EcoRI單酶切產(chǎn)生一條5.8 kb片段。結(jié)果見圖2。圖2　重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2　Identification of recombinant plasmid by restrictionenzyme digestion1:DNA Marker DL2000;2:pGEX-6P-1 plasmid;3:pGEX-6P-1 digested byEcoRⅠ; 4: pGEX-6P-1 di-gested byEcoRⅠandXhoⅠ;5:recombined plasmid;6:recombined plasmid digested byEcoRⅠ;7:recom-bined plasmid digested byEcoRⅠandXhoⅠ;8:λ-HindⅢdigest; 9:p1gene fragment amplificed byPCR4712005, 21 (6)中國(guó)人獸共患病雜志Chinese Journal of Zoonoses

為99.32%~100%。2·4　重組蛋白表達(dá)和活性檢測(cè)　從SDS-PAGE結(jié)果(圖3-A)可見誘導(dǎo)表達(dá)的樣品在Mr大約59kDa處有明顯條帶。免疫印記雜交結(jié)果顯示(圖3-B),兔多價(jià)抗血清與過柱純化的重組蛋白在59kDa處形成了特異的抗原-抗體反應(yīng)條帶,空白對(duì)照沒有,說明該重組蛋白可被兔抗MP多價(jià)抗體識(shí)別,其含有P1黏附因子的特異性抗原決定簇。圖3　GST-P1 Western Blotting分析(箭頭所示為表達(dá)帶)Fig.3　Western Blotting analysis of GST-P1A.SDS-PAGE 1:protein marker;2:bland control;3,4:purified fusion protein;B.Western Blottig3　討　　論有研究表明,P1黏附蛋白與黏附相關(guān)蛋白P30和40、90kDa的膜蛋白串聯(lián)在一起,是Mp有效黏附于宿主細(xì)胞所必需的〔1〕。已報(bào)道在P1黏附蛋白C末端含有高免疫區(qū)及與黏附有關(guān)的D2區(qū)〔2

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