【摘要】： 人類紅細(xì)胞的血紅蛋白是由α-珠蛋白基因簇編碼的兩條珠蛋白肽 鏈及β-珠蛋白基因簇編碼的兩條珠蛋白肽鏈組成的四聚體。α基因簇位 于16號(hào)染色體，含四個(gè)功能基因，依次為5’-ζ-α_1-α_2-θ-3’；β基因 簇位于11號(hào)染色體，含5’-ε-~Gγ-~Aγ-δ-β-3’五個(gè)功能基因。人類各珠 蛋白基因表達(dá)具有一定的時(shí)間性及空間性，對(duì)每一類基因，某一階段僅 表達(dá)一個(gè)或以一個(gè)基因表達(dá)為主。當(dāng)某一基因發(fā)生突變，其轉(zhuǎn)錄效率， mRNA的穩(wěn)定性，及編碼功能等都可能不同程度地發(fā)生異常，并可能影 響同簇其它基因的表達(dá)。地中海貧血即是因珠蛋白基因異常而引起的一 種主要在兒童期起病的遺傳性溶血性貧血。人們根據(jù)突變珠蛋白基因的 不同而將其分為α-，β-，δβ-，及γδβ-地貧等四種類型。本病在地 中海沿岸，東南亞及我國的廣東，廣西，四川等地高發(fā)，對(duì)兒童健康影 響很大，目前尚無有效的治療手段。對(duì)突變基因，正�；虻难芯浚� 望為臨床治療疾病提供理論基礎(chǔ)。 近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們?cè)诨蛩揭褜?duì)地中海 貧血的分子機(jī)制進(jìn)行了深入而廣泛的研究。而基因工程技術(shù)的日漸完善， 亦為人們研究珠蛋白基因調(diào)控機(jī)制提供了有效的手段，這些均使人們?nèi)?益注重基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的研究。為此，一個(gè)行之有效的檢測珠蛋白基因轉(zhuǎn) 錄水平的方法迫切需要建立。 國外已往的研究，多采用RT-PCR法，亦有采用探針法對(duì)珠蛋白基 因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量。但每次僅局限于2-4種珠蛋白基因，在同時(shí)研究 各種類型地中海貧血甚至復(fù)合型地中海貧血的致病機(jī)制，及全面系統(tǒng)地 研究珠蛋白基因表達(dá)切換規(guī)律，研究基因調(diào)控機(jī)制等時(shí)，其應(yīng)用即受到 限制。而國內(nèi)在此領(lǐng)域的研究開展得不多。目前尚未見同時(shí)對(duì)七種珠蛋 白基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行監(jiān)測的報(bào)道。 本研究的目的即是建立一個(gè)能同時(shí)對(duì)7種珠蛋白基因（α，β，~A γ，~Gγ，，δ，ε，ζ）轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量的方法。由于探針定量法RNA需量 大，尤其對(duì)兒童不適宜，且RNA易降解，操作時(shí)條件要求高，因此我們 D 選用盯－pCR t作為定量方汪。D l 在外周血中含量高，尚含RNA，故被用于珠蛋白某因轉(zhuǎn)錄的研究中。在l D 本研冤中我們宜先對(duì)外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞的分離方法進(jìn)行了改良，配制出D D 一種可高產(chǎn)量分離網(wǎng)織紅細(xì)胞的細(xì)胞分離液，并將與常用的淋巴細(xì)胞分D l 離液相比較，證明效果好，產(chǎn)量高。我們又對(duì)細(xì)胞質(zhì) NA提取方法進(jìn)行 l DJ嘆臣，經(jīng)勺并腑氰限肌活比牧，顯不廣重同，和盯少，且N＠叮捉臍D D 口＊A，尤耳適用于地窗等需同肘對(duì)其某因水平講行定體研究時(shí)。巾干同D D 族壞蚤曰基兇的問源性很局，在撥計(jì)引物時(shí)，除考慮W密碼于的兼D l 最終自行設(shè)計(jì)出 13條共七對(duì)引物，經(jīng)基因庫擬合，確證特異。且產(chǎn)物片 l D 段眾皮與狽朋陰一致。在硼定僅匝懷殺組成過程中，多次對(duì)＊才”濃度進(jìn)D D 行調(diào)整，最終確定 17．5－20mM為適宜濃度。在 PCR參數(shù)選擇上，經(jīng)多次 D l＆索條件，當(dāng) 94’C，50’C及 72’C各 lmin時(shí)，即可全部擴(kuò)增出 7種產(chǎn)物，l D 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件時(shí)。將每個(gè)循環(huán)的退火時(shí)間縮短30s。。，延伸時(shí)間縮短D 120see，仍可得到特異的產(chǎn)物，但每次循環(huán)時(shí)間可節(jié)約 25分鐘。l D 利用新建的方法從臍血，正常嬰兒及成人外周血中分離網(wǎng)織紅細(xì)胞，D l 提＆ RNA后，進(jìn)行 RT－PCR 顯示隨著年齡的增長，胚胎型珠蛋白基因 l Iy，。的相對(duì)量呈下降趨勢，表現(xiàn)為。Iy．mopA從臍血的 0．54，到 61 l 月時(shí)的 0．87，成人的 1刀5。a／。－mRNA自 1．42，1．76，到 2．36，符合已 l D 知基因表達(dá)切換規(guī)律，即在個(gè)體發(fā)牛發(fā)育過租中．琳胳型珠蛋R某田優(yōu)D l 無農(nóng)這，隨二漸被具他成人型基囚代督。且葉Y－mRNA的變化與HbF l 陰要化一欺。驗(yàn)證了本方法的可信性。進(jìn)一步又對(duì)7例地中海盆血患者l lgn＃ffi臼 iRNA作出相對(duì)定量，在兩例攜帶 Q．地貧 l＄因的患者中，l D 檢測到 g－mRNA RT－PCR產(chǎn)物，同時(shí) a．mANA的 RT－pCR產(chǎn)物量明顯下 D D 降，符合缺失型突變的預(yù)期的致病機(jī)理。曠純合子較p’雙重雜合子的D Da川－mRNA低，而曠雜合子則比其純合子低．與預(yù)湖結(jié)訟一＠。以佑D D 外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞提取的RNA作空白對(duì)照，用RTPCR檢測珠番白某田D D 轉(zhuǎn)求水干，5份標(biāo)本結(jié)果全陰，初步顯示此方法假陽性率低。D l 此足重萬法側(cè)步嘆用顯不，結(jié)果可靠，省時(shí)（較以前方法至少節(jié)約l l 三分之二時(shí)間），假陽性率低。l 1．4．l I 此定量方法除可在各種地中海貧血突變基因的致病機(jī)理及人類珠蛋 D 白基因表達(dá)切換規(guī)律的分析中應(yīng)用外，尚可用于藥物調(diào)控珠蛋白基因表 D 達(dá)機(jī)理及珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等的實(shí)驗(yàn)研究中。由于
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2600890