【摘要】：目的：克隆抗p185單抗5E12的Fab段基因，構建其表達載體并在原核細胞進行功能性表達。方法： 用逆轉錄-聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)，以可變區(qū)第一骨架區(qū)的通用引物從分泌抗p185單抗的雜交瘤細胞系5E12中克隆Fd段和(鏈的基因，重組到Fab表達載體中，在大腸桿菌中表達噬菌體抗體和可溶性Fab;根據(jù)前導肽序列設計引物，克隆抗p185的Fd段和κ鏈基因，獲得其氨基端原始序列；根據(jù)原始序列設計引物，通過PCR介導的定點突變將V區(qū)基因氨基端序列恢復為5E12的原始序列；以NIH3T3/erbB-2細胞ELISA法 、免疫組化法等進行特異性鑒定。結果：以第一骨架區(qū)的通用引物從小鼠雜交瘤細胞5E12中克隆到Fd段和(鏈的基因，在大腸桿菌中表達出Fab段但無特異性抗原結合活性；采用噬菌體抗體庫技術建立噬菌體抗體庫，反復篩選均未篩出陽性克�。环謩e將Fd段和(鏈V區(qū)基因的氨基端序列矯正為親本單抗的原始序列后，，終于得到可與轉染erbB-2基因的3T3/erbB-2細胞結合的小分子抗體。通過比較突變前后Fab段的分泌表達，發(fā)現(xiàn)無論輕鏈或重鏈可變區(qū)氨基端序列的變化均不影響Fab段的分泌量，而是影響了抗體和抗原的結合。單獨恢復重鏈可變區(qū)氨基端序列可恢復抗原結合活性。但同時恢復輕鏈后活性未見進一步提高，反而有下降的趨勢。提示在與抗原結合的過程中，重鏈的作用是主要的，同時輕鏈也可影響抗體與抗原的結合。結論：成功構建了抗p185小分子抗體Fab的表達載體并進行功能性表達，為進一步構建抗抗p185 鼠單抗其他小分子抗體及其人源化改造打下基礎；進一步證實抗體氨基端序列對抗體活性的重要性，為今后以PCR方法構建小分子抗體的工作提供了有益的借鑒。
【圖文】：

3圖 1-2、可溶性 Fab 表達載體 p3MHS 圖譜Fig.1-2 soluble Fab expression vector p3MHS1．2 寡核苷酸引物：自第一骨架區(qū)擴增Fd和κ鏈的PCR 通用引物：參考文獻[33]，加以適當，設計如下:κ鏈5' 端引物MK5 1～3 引入內切酶SacI位點， κ鏈3' 端MK3引入XbaI位點； Fd段5' 端引物MH5引入XhoI位點， Fd段3' 端引13引入SpeI位點(下劃線部分)。(W=T/A，K=T/G，S=C/G，Y=C/T，M=C/

PCR 擴增雜交瘤抗體基因CR 產物; 2: Fd 段 PCR 產物重組到 pGEM- T 載體。經篩選，挑白色克隆，培養(yǎng)aI 鑒定κ鏈，可見質粒經入片段，表明有κ鏈 的 的原載體帶和 700bp 的 F
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 李競,王琰,王卓智,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,董志偉;抗胃癌單抗3H11可變區(qū)氨基端序列對抗體活性的影響[J];生物化學與生物物理進展;1999年04期

2 許金華,杜紅,楊蔚,孫素蓮;抗p185單克隆抗體的制備及初步應用[J];細胞與分子免疫學雜志;1997年03期

3 馬泓,劉美生,何洛文,楊蔚,孫素蓮;乳腺癌之c-erbB-2高度擴增、表達與雌孕激素受體的相關性[J];中國腫瘤臨床;1998年02期

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5 李競,王琰,李全喜,王雅明,徐建軍,王力民,董志偉;抗胃癌單抗3H11的單鏈抗體表達載體的構建和表達[J];中華腫瘤雜志;1998年02期

本文編號：2588637