【摘要】：目的：克隆抗p185單抗5E12的Fab段基因，構(gòu)建其表達(dá)載體并在原核細(xì)胞進(jìn)行功能性表達(dá)。方法： 用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)，以可變區(qū)第一骨架區(qū)的通用引物從分泌抗p185單抗的雜交瘤細(xì)胞系5E12中克隆Fd段和(鏈的基因，重組到Fab表達(dá)載體中，在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體抗體和可溶性Fab;根據(jù)前導(dǎo)肽序列設(shè)計(jì)引物，克隆抗p185的Fd段和κ鏈基因，獲得其氨基端原始序列；根據(jù)原始序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變將V區(qū)基因氨基端序列恢復(fù)為5E12的原始序列；以NIH3T3/erbB-2細(xì)胞ELISA法 、免疫組化法等進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果：以第一骨架區(qū)的通用引物從小鼠雜交瘤細(xì)胞5E12中克隆到Fd段和(鏈的基因，在大腸桿菌中表達(dá)出Fab段但無(wú)特異性抗原結(jié)合活性；采用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)建立噬菌體抗體庫(kù)，反復(fù)篩選均未篩出陽(yáng)性克��；分別將Fd段和(鏈V區(qū)基因的氨基端序列矯正為親本單抗的原始序列后，，終于得到可與轉(zhuǎn)染erbB-2基因的3T3/erbB-2細(xì)胞結(jié)合的小分子抗體。通過(guò)比較突變前后Fab段的分泌表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無(wú)論輕鏈或重鏈可變區(qū)氨基端序列的變化均不影響Fab段的分泌量，而是影響了抗體和抗原的結(jié)合。單獨(dú)恢復(fù)重鏈可變區(qū)氨基端序列可恢復(fù)抗原結(jié)合活性。但同時(shí)恢復(fù)輕鏈后活性未見(jiàn)進(jìn)一步提高，反而有下降的趨勢(shì)。提示在與抗原結(jié)合的過(guò)程中，重鏈的作用是主要的，同時(shí)輕鏈也可影響抗體與抗原的結(jié)合。結(jié)論：成功構(gòu)建了抗p185小分子抗體Fab的表達(dá)載體并進(jìn)行功能性表達(dá)，為進(jìn)一步構(gòu)建抗抗p185 鼠單抗其他小分子抗體及其人源化改造打下基礎(chǔ)；進(jìn)一步證實(shí)抗體氨基端序列對(duì)抗體活性的重要性，為今后以PCR方法構(gòu)建小分子抗體的工作提供了有益的借鑒。
【圖文】：

3圖 1-2、可溶性 Fab 表達(dá)載體 p3MHS 圖譜Fig.1-2 soluble Fab expression vector p3MHS1．2 寡核苷酸引物：自第一骨架區(qū)擴(kuò)增Fd和κ鏈的PCR 通用引物：參考文獻(xiàn)[33]，加以適當(dāng)，設(shè)計(jì)如下:κ鏈5' 端引物MK5 1～3 引入內(nèi)切酶SacI位點(diǎn)， κ鏈3' 端MK3引入XbaI位點(diǎn)； Fd段5' 端引物MH5引入XhoI位點(diǎn)， Fd段3' 端引13引入SpeI位點(diǎn)(下劃線部分)。(W=T/A，K=T/G，S=C/G，Y=C/T，M=C/

PCR 擴(kuò)增雜交瘤抗體基因CR 產(chǎn)物; 2: Fd 段 PCR 產(chǎn)物重組到 pGEM- T 載體。經(jīng)篩選，挑白色克隆，培養(yǎng)aI 鑒定κ鏈，可見(jiàn)質(zhì)粒經(jīng)入片段，表明有κ鏈 的 的原載體帶和 700bp 的 F
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 李競(jìng),王琰,王卓智,劉群英,化冰,陳宇萍,朱迎春,董志偉;抗胃癌單抗3H11可變區(qū)氨基端序列對(duì)抗體活性的影響[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1999年04期

2 許金華,杜紅,楊蔚,孫素蓮;抗p185單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1997年03期

3 馬泓,劉美生,何洛文,楊蔚,孫素蓮;乳腺癌之c-erbB-2高度擴(kuò)增、表達(dá)與雌孕激素受體的相關(guān)性[J];中國(guó)腫瘤臨床;1998年02期

4 李競(jìng),王琰,李全喜,王雅明,徐建軍,王力民,董志偉;抗胃癌鼠單抗 3H11V 區(qū)基因的克隆及人-鼠嵌合輕鏈的表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年03期

5 李競(jìng),王琰,李全喜,王雅明,徐建軍,王力民,董志偉;抗胃癌單抗3H11的單鏈抗體表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J];中華腫瘤雜志;1998年02期

本文編號(hào)：2588637