【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES cells)是一類具有自我更新和發(fā)育全能性的早期胚胎細(xì)胞，本研究通過誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞體外分化，建立了ES細(xì)胞體外血管生成和血管新生的序慣性模型，為研究血管形成的體內(nèi)過程與血管形成有關(guān)的基因功能，評價血管形成促進(jìn)和抑制因子提供了一個有用的工具；同時研究了血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(PECAM-1／CD31)在ES細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律，探討了PECAM-1在ES細(xì)胞分化過程中的作用。 第一部分 (1) 體外培養(yǎng)ES細(xì)胞誘導(dǎo)形成胚胎小體(embryoid body，EB)，將11d的EB種植到膠原中誘發(fā)出芽性血管新生；通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測EB及其出芽向內(nèi)皮細(xì)胞和功能血管的分化；(2) 通過懸滴培養(yǎng)的方法，將培養(yǎng)6d的EB在全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)的作用下向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化；(3) 將培養(yǎng)11d的EB消化成單個細(xì)胞后，種植到甲基纖維素中，向造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化。結(jié)果顯示，ES細(xì)胞在體外能自發(fā)形成EB，其內(nèi)部含有血管樣結(jié)構(gòu)，并伴有平滑肌的分化；種植到膠原中的胚胎小體能再現(xiàn)出芽性血管新生(sprouting angiogenesis)；ES細(xì)胞在體外同時也能分化成神經(jīng)和造血細(xì)胞。 第二部分 體外培養(yǎng)ES細(xì)胞，保持其未分化狀態(tài)，利用免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR等方法檢測ES細(xì)胞未分化標(biāo)志SSEA-1、堿性磷酸酶、Oct-4及PECAM-1的表達(dá)情況，同時，用流式細(xì)胞儀檢測PECAM-1與其他內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)的關(guān)系。應(yīng)用克隆分析的方法檢測不同剪接體的表達(dá)分布。體外培養(yǎng)ES細(xì)胞，保持其未分化狀態(tài)，同時在細(xì)胞因子的作用下誘導(dǎo)形成胚胎小體(EB)；然后將EB種植到膠原中，在細(xì)胞因子的作用下誘導(dǎo)出芽性血管新生。分別利用免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)等方法檢測ES細(xì)胞及其分化過程中PECAM-1、Oct-4及SSEA-1的表達(dá)。應(yīng)用克隆分析的方法檢測不同的PECAM-1剪接體在EB形成和出芽性血管新生過程中的表達(dá)分布。結(jié)果顯示未分化的ES細(xì)胞表達(dá)較高水平的PECAM-1，表達(dá)8種PECAM-1的剪接體，包括全長、△12、△14、△15、△1214、△1215、△1415、△121415，其中△15和△1415表達(dá)水平最高。
[Abstract]:Embryonic stem cells (embryonic stem cells es cells) are a kind of early embryonic cells with self-renewal and developmental totipotency. In this study, we established an order inertia model of es cell angiogenesis and angiogenesis by inducing mouse es cells to differentiate in vitro. It provides a useful tool for studying the gene function related to angiogenesis in vivo and evaluating angiogenesis promoting and inhibiting factors. The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1/CD31) in es cells and the role of PECAM-1 in es cell differentiation were studied. The results were as follows: (1) es cells were cultured in vitro to form embryoid body (EB), and 11 d EB was implanted into collagen to induce budding angiogenesis, and the differentiation of EB and its budding into endothelial cells and functional vessels was detected by immunohistochemical staining. (2) EB cultured for 6 days was induced to differentiate into neural cells by suspension culture, and EB cultured for 11 days was digested into a single cell, then implanted into methylcellulose to induce differentiation into hematopoietic cells. The results showed that the EBs cells formed spontaneously in vitro, which contained vascular-like structure and differentiation of smooth muscle. Small embryo implanted into collagen could reproduce budding angiogenesis (sprouting angiogenesis);. Es cells can also differentiate into nerve and hematopoietic cells in vitro. In the second part, es cells were cultured in vitro to maintain their undifferentiated state. The expression of undifferentiated markers SSEA-1, alkaline phosphatase Oct-4 and PECAM-1 were detected by immunohistochemistry, flow cytometry and RT-PCR. The relationship between PECAM-1 and other endothelial cell markers was detected by flow cytometry. Clone analysis was used to detect the expression distribution of different splicing bodies. Es cells were cultured in vitro to maintain their undifferentiated state. At the same time, embryonic body (EB); was induced by cytokines, then EB was implanted into collagen to induce budding angiogenesis. Immunohistochemistry, flow cytometry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the expression of PECAM-1 Oct-4 and SSEA-1 in es cells and their differentiation. Cloning analysis was used to detect the expression distribution of different PECAM-1 splicing bodies during EB formation and budding angiogenesis. The results showed that the undifferentiated es cells expressed a high level of PECAM-1, and expressed eight splicing bodies of PECAM-1, including the full length, 1214, 15, 1214, 1215, 1415, 121415, among which 15 and 1415 were the highest.
【學(xué)位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R329

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本文編號：2159618