【摘要】： 目的:構建內源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表達載體,優(yōu)化表達條件,初步探討表達蛋白的抑制血管活性。 方法:從GenBank庫中查找Arresten基因并獲取其基因序列及蛋白序列,用DNAman軟件設計引物。從健康產婦胎盤組織中提取人總RNA,經(jīng)逆轉錄—聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出Arresten基因,低熔點瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化,純化產物和質粒pBV220連接,并轉化E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)感受態(tài)細胞,在氨芐陽性平板中篩選陽性菌落。重組質粒用PCR法和三種限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和PvuⅡ(基因序列155位的酶切位點)酶切進行鑒定,并進行序列測定,命名為pBV220-Arr。構建的重組質粒pBV220-Arr轉化到宿主菌——E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中進行原核表達。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳圖條帶分析,并結合濕菌重篩選出最優(yōu)表達菌種,進行培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、表達溫度、表達時間及溶解氧量五方面表達,確定最優(yōu)表達體系;超聲破菌,分離得到包涵體,并對其進行洗滌純化復性,考馬斯亮藍法測定蛋白含量;雞胚絨毛尿囊膜實驗觀察新生血管生長抑制情況。 結果:成功篩選出Arresten基因,通過測序結果表明在第132、148、200、236位基因序列不同;通過成功構建的重組質粒pBV220-Arr,在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中均表達出Arresten蛋白,SDS-PAGE顯示表達產物分子量約為26KD,表達產物主要以包涵體形式存在;通過優(yōu)化表達,結果在E.coli BL21(DE3)中30℃培養(yǎng)4 h,42℃誘導表達4 h,溶解氧量比例在1㑳5時表達量達到最高,表達量約占全菌蛋白的25%以上;進一步純化表達,用2 mol/L尿素、2%的Triton X-100溶液和1M的蔗糖溶液,及少許的EDTA洗滌效果最好,表達量約占全菌蛋白的40%以上,用梯度稀釋法復性得到Arresten蛋白;經(jīng)活性分析證實初步復性的Arresten蛋白與陰性對照組比較統(tǒng)計學上有顯著性差異,證明其有抑制新生血管生成的作用。 結論:應用基因工程技術,成功篩選出Arresten基因,并構建了原核表達重組體pBV220-Arr;通過優(yōu)化表達,得到最優(yōu)表達菌種E.coli BL21(DE3)及最優(yōu)表達條件,能高效表達重組Arresten蛋白;經(jīng)過用尿素與Triton X-100及蔗糖溶液綜合方法洗滌純化,純化效果最好并獲得了較純的Arresten蛋白;經(jīng)過CAM試驗證明,該蛋白具有良好的抑制新生血管生成的活性;Arresten蛋白具有良好的應用前景,通過對Arresten蛋白的研究,為進一步大規(guī)模高效表達和純化Arresten目的蛋白提供了可靠的實驗方法,也為腫瘤的基因治療研究奠定了基礎。
[Abstract]:Aim: to construct the prokaryotic expression vector of endogenous angiogenesis inhibitor (Arresten) gene, optimize the expression conditions and explore the inhibition of angiogenesis activity of the expression protein. Methods: Arresten gene was searched from GenBank library and its gene sequence and protein sequence were obtained. Primers were designed by DNAman software. The Arresten gene was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) from placental tissue of healthy puerpera. The Arresten gene was purified by gel electrophoresis with low melting point agarose gel electrophoresis. The purified product was ligated with plasmid pBV220, and transformed into E.coli JM109 DH5 偽 -BL21 BL21 (DE3) cell. Positive colonies were screened in ampicillin positive plate. The recombinant plasmids were identified by PCR and restriction endonuclease BamH 鈪，

本文編號：2155838