【摘要】：α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)是人類血漿中最豐富的蛋白酶抑制物,主要是由肝細胞合成的一種糖蛋白,在單核巨噬細胞、腸上皮細胞、腎實質(zhì)等肝外組織及某些腫瘤細胞中也能產(chǎn)生,它能抑制多種蛋白酶及多種絲氨酸內(nèi)切肽酶。1989年,人血漿α1-AT制劑獲得美國FDA批準用于嚴重α1-AT缺乏的患者的替代治療。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,重組人血漿α1-AT獲得成功表達,但目前尚無重組表達的產(chǎn)品被批準上市。 目前經(jīng)FDA批準應(yīng)用于α1-AT缺乏疾病替代治療的α1-AT制劑仍供不應(yīng)求,國內(nèi)尚無同類產(chǎn)品問世,且生產(chǎn)血液制劑要產(chǎn)生大量的Cohn FIV-1廢棄組分,因此開發(fā)新血液制劑α1-AT無論在血漿綜合利用理論研究及實際應(yīng)用方面均具有重要意義。 以Cohn FIV-1組分為原料,加適量脂蛋白去除劑(LRA)室溫攪拌1小時處理后,經(jīng)四種不同的層析純化工藝路線分離純化α1-抗胰蛋白酶,其中DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-200凝膠過濾層析和Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-200凝膠過濾層析兩種純化工藝純化的α1-AT分別達到100%和95%。對DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-200凝膠過濾層析純化α1-AT的工藝進行初步放大,純化的α1-AT純度仍可達95.5%。純化的α1-AT表觀分子量為55.9kD,p14.55,為酸性蛋白質(zhì)。用免疫雙擴散試驗、微量免疫電泳、免疫印跡分析對其進行鑒定,證明其具有良好的免疫反應(yīng)性及較高的純度。以胰蛋白酶抑制能力試驗(微量法)測其生物活性,DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-200凝膠過濾層析純化的α1-AT比活性為680.67±34.58IU/mg(n=3),活性回收率為48.35±5.15%(n=3);Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-200凝膠過濾層析純化工藝純化的α1-AT比活性為328.00±44.42IU/mg(n=3),活性回收率為30.40±5.23%(n=3);前一種層析純化工藝路線初步放大試驗所獲α1-AT比活性為645.43±
[Abstract]:偽 1-antitrypsin (偽 1-AT) is the most abundant protease inhibitor in human plasma. It is mainly a glycoprotein synthesized by hepatocytes. It is also produced in mononuclear macrophages, intestinal epithelial cells, renal parenchyma and some tumor cells. In 1989, human plasma 偽 1-AT preparation was approved by FDA for replacement therapy in patients with severe 偽 1-AT deficiency. With the development of genetic engineering technology, recombinant human plasma 偽 1-AT has been successfully expressed, but no recombinant expression product has been approved. At present, 偽 1-AT preparations approved by FDA for 偽 1-AT lack of disease replacement therapy are still in short supply, no similar products have been produced in China, and the production of blood preparations should produce a large number of waste components of Cohn FIV-1. Therefore, the development of new blood preparation 偽-1-AT is of great significance in the theoretical study and practical application of plasma utilization. 偽 1-antitrypsin was separated and purified by four different chromatographic purification processes using Cohn FIV-1 component as raw material and lipoprotein remover (LRA) stirred for 1 hour at room temperature. The 偽 1-AT purified by DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography combined with Sephacryl S-200 gel filtration chromatography and Q-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography combined with Sephacryl S-200 gel filtration chromatography was 100% and 95% respectively. The purification process of 偽 1-AT by DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration chromatography was amplified, and the purity of 偽 1-AT was still up to 95. 5%. The apparent molecular weight of the purified 偽 1-AT is 55.9 kDX p14.55, which is an acidic protein. Double immunodiffusion assay, microimmunoelectrophoresis and immunoblotting analysis were used to identify it. It was proved that it had good immunoreactivity and high purity. The specific activity of 偽 1-AT purified by DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography combined with Sephacryl S-200 gel filtration chromatography was 680.67 鹵34.58IU/mg (Nm3) by trypsin inhibition test (trace method). The recovery rate of 偽 1-AT was 48.35 鹵5.15% (nun3) Q-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography combined with Sephacryl. The specific activity of 偽 1-AT purified by S-200 gel filtration chromatography process was 328.00 鹵44.42IU/mg (Nm3), and the recovery rate was 30.40 鹵5.23% (Nm3), and the specific activity of 偽 1-AT obtained from the preliminary amplification test of the previous purification process was 645.43 鹵5.23%.
【學位授予單位】：北京生物制品研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R341

【共引文獻】

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本文編號：2142834