【摘要】： 背景和目的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是微需氧的革蘭陰性桿菌，呈螺旋狀。多數(shù)國(guó)家和地區(qū)Hp感染率高達(dá)50％以上，許多感染者都是無癥狀的，但是有部分感染者可出現(xiàn)急慢性胃炎和消化性潰瘍，Hp的持續(xù)性感染還與胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Hp已被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌因子。近年流行病學(xué)資料還發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染還與冠心病、動(dòng)脈硬化、血小板減少性紫癜、糖尿病、缺鐵性貧血、慢性特發(fā)性蕁麻疹、支氣管炎等發(fā)病有關(guān)。 尿素酶是Hp的一種重要毒力因子，它能夠?qū)⒛蛩胤纸獬蔀榘睔夂投趸迹灾泻臀覆康乃嵝原h(huán)境，有利于Hp的定植。尿素酶占細(xì)菌總蛋白的10％左右。尿素酶B亞基(UreB)是尿素酶的大亞基，且是尿素酶催化位點(diǎn)所在亞基。UreB在各螺桿菌屬間序列保守，且具有較強(qiáng)的抗原性，故吸引了較多學(xué)者研究基于UreB的疫苗。國(guó)內(nèi)外利用重組尿素酶B亞基研制疫苗均在一定程度上能引起免疫應(yīng)答，但無法在清除Hp效果上達(dá)成一致。只包含一種抗原蛋白的疫苗所誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用通常較弱，實(shí)際應(yīng)用可用性不高。 近年發(fā)展起來的含多個(gè)和多種抗原表位(epitope)的多抗原肽(multipleantigenic peptide，MAP)研究策略，極有可能成為解決亞基問題有效途徑。尋找有效的抗原表位是研制MAP的第一步。研究抗原表位可深層次地揭示蛋白抗原分子誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機(jī)制及其特點(diǎn)，并在研制新型分子疫苗、新型血清學(xué)檢測(cè)方法等方面有重要應(yīng)用前景。本研究擬篩選幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)分子中的B以及Th細(xì)胞抗原表位，為研制多抗原肽(MAP)疫苗奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法Ni-NTA親和層析法提純目的重組表達(dá)產(chǎn)物rUreB，，常規(guī)皮內(nèi)免疫法制備兔抗血清。采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)UreB的B細(xì)胞和Th細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。選擇UreB主要B細(xì)胞和Th細(xì)胞聯(lián)合表位肽并融合表達(dá)于M13KE噬菌體PⅢ蛋白上，PEG／NaCl沉淀法提純重組噬菌體，SDS-PAGE鑒定目的重組PⅢ蛋白(rPⅢ)。分別以自制備rUreB抗血清和商品化抗Hp全菌IgG為一抗，采用Western blot對(duì)上述表位肽進(jìn)行鑒定和篩選。 結(jié)果rUreB表達(dá)量約為細(xì)菌總蛋白的30％，提純后僅見單一蛋白條帶。免疫家兔后獲得抗血清。與GenBank中相關(guān)序列比較，本實(shí)驗(yàn)室的ureB基因核苷酸和氨基酸相似性分別為96％～99.5％和96％～100％。綜合預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇4個(gè)同時(shí)含有Th細(xì)胞和B細(xì)胞表位肽段UreB230、UreB322、UreB479和UreB527，并在M13噬菌體中獲得成功表達(dá)，采用不同一抗的Western blot均顯示相似的陽(yáng)性結(jié)果，但UreB322和UreB527反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于UreB230和UreB479。 結(jié)論本研究成功獲得重組UreB蛋白，并得到兔抗血清。構(gòu)建了Th細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合表位肽段的噬菌體展示系統(tǒng)。所采用的生物信息學(xué)技術(shù)可有效地預(yù)測(cè)抗原表位。實(shí)驗(yàn)室鑒定UreB322和UreB527為UreB有效抗原表位，可作為幽門螺桿菌MAP疫苗的候選表位。
[Abstract]:Background and objective Helicobacter pylori (Hp) is a micro aerobic gram-negative bacilli, which is spiral. In most countries and regions, the rate of Hp infection is more than 50%. Many infected people are asymptomatic, but some infected people can appear acute and chronic gastritis and peptic ulcers. The persistent infection of Hp is also associated with gastric adenocarcinoma and gastric lymph nodes. .Hp has been listed as a class I carcinogenic factor by WHO. In recent years, the epidemiological data also found that Helicobacter pylori infection is associated with coronary heart disease, arteriosclerosis, thrombocytopenic purpura, diabetes, iron deficiency anemia, chronic idiopathic urticaria, bronchitis, and so on.
Urease is an important virulence factor of Hp, which can decompose urea into ammonia and carbon dioxide to neutralize the acid environment of the stomach and facilitate the colonization of Hp. The urease is about 10% of the total bacterial protein. The urease B subunit (UreB) is the large subunit of the urease, and the subunit of the urease catalyzed site.UreB is in the genus Helicobacter. It is conservative and has strong antigenicity, which attracts many scholars to study the vaccine based on UreB. The use of recombinant urease B subunit to produce vaccines to some extent can cause immune response, but can not achieve agreement on the effect of eliminating Hp. The immunization induced by a vaccine containing only one antigen protein is effective. It is often weak, and the practical application is not high.
The research strategy of multiple antigenic epitopes (epitope) with multiple antigen epitopes (multipleantigenic peptide, MAP), which has been developed in recent years, is very likely to be an effective way to solve subunit problems. Finding effective antigen epitopes is the first step in the development of MAP. The study of antigen epitopes can deeply reveal the immune response induced by protein antigen molecules. The molecular mechanism and its characteristics have an important application prospect in the development of new molecular vaccines and new serological detection methods. This study intends to screen B and Th cell antigen epitopes of Helicobacter pylori urease B subunit (UreB), laying a foundation for the development of polyantigenic peptide (MAP) vaccine.
The recombinant expression product rUreB was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The rabbit antiserum was prepared by routine intradermal immunization. Bioinformatics was used to predict and analyze the epitopes of B and Th cells of UreB. The combined epitopes of the UreB main B cells and Th cells were selected and the fusion table was reached on the M13KE phage P III protein, PEG / NaCl. The recombinant phage was purified by precipitation method, and the recombinant P III protein (rP III) was identified by SDS-PAGE. RUreB antiserum and commercialized anti Hp whole bacteria IgG were used as one antibody, respectively, and the above epitope peptides were identified and screened by Western blot.
Results the expression of rUreB was about 30% of the total bacterial protein. After purification, only a single protein band was found. After immunizing the rabbit, the antiserum was obtained. Compared with the related sequences in GenBank, the nucleotide and amino acid similarity of the ureB gene in our laboratory was 96% to 99.5% and 96% to 100%., respectively, and 4 had Th cells and B. The cell epitope peptide segments UreB230, UreB322, UreB479 and UreB527 were successfully expressed in the M13 phage. The use of different Western blot showed similar positive results, but the reaction intensity of UreB322 and UreB527 was significantly higher than that of UreB230 and UreB479..
Conclusion the recombinant UreB protein was successfully obtained and rabbit antiserum was obtained. The phage display system of the joint epitope of Th cells and B cells was constructed. The bioinformatics techniques used can effectively predict the epitopes of the antigen. The effective antigen epitopes of UreB322 and UreB527 are identified in the laboratory and can be used as the MAP vaccine of Helicobacter pylori. Select the table.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2131901