發(fā)布時間：2018-07-14 07:37

【摘要】：目的:建立穩(wěn)定表達(dá)人血栓調(diào)節(jié)蛋白(hTM)的克隆細(xì)胞株,制備抗hTM單克隆抗體(McAb),為心血管疾病的研究提供基礎(chǔ)。方法:(1) 重組表達(dá)質(zhì)粒pThr402提純后經(jīng)lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO,經(jīng)G418篩選,流式細(xì)胞術(shù)及Western blotting檢測,獲得穩(wěn)定高表達(dá)hTM的克隆細(xì)胞株CHO-TM。(2) 采用CHO-TM細(xì)胞作為免疫原,免疫Balb/c雌性小鼠,按常規(guī)方法融合并經(jīng)CELISA法篩選,制備穩(wěn)定分泌抗人血栓調(diào)節(jié)蛋白MaAb的克隆細(xì)胞株,并對McAb的亞類、免疫活性、細(xì)胞與組織特異性及識別抗原特異性進(jìn)行鑒定。(3) 收集動脈粥樣硬化病人血標(biāo)本,將抗人血栓調(diào)節(jié)蛋白McAb應(yīng)用于Western blotting檢測病人的sTM水平。結(jié)果:(1) 成功獲得了穩(wěn)定、高效表達(dá)hTM的克隆細(xì)胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6。其中CHO-TM6的表達(dá)量最高,陽性細(xì)胞百分率與平均熒光強度分別為89.00%和9.84。(2) 成功制備了抗人血栓調(diào)節(jié)蛋白McAb,命名為NH-1。瓊脂糖免疫雙擴散法鑒定NH-1的重鏈為IgGl亞類。CELISA法測定其腹水效價為5×10~(-5),M750-B紫外分光光度儀測定腹水抗體含量為20mg/ml。流式細(xì)胞儀檢測該抗體與CHO-TM6和HUVEC呈陽性反應(yīng),與CHO及正常人外周紅細(xì)胞、白細(xì)胞、未活化血小板呈陰性反應(yīng)。ABC免疫組織化學(xué)法檢測正常人組織切片顯示其該抗體除與子宮和前列腺有交叉反應(yīng)外,與小腸、胸腺、脾、甲狀腺、膽囊、卵巢、膀胱、肝臟、腎臟、胃等組織呈陰性反應(yīng),各組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞均有hTM表達(dá)。Western blotting分析顯示McAb NH-1可特異地識別還原條件下相對分子量為105KD左右的蛋白多肽。(3) McAb NH-1可用于Western blotting檢測動脈粥樣硬化病人的sTM水平。結(jié)論:(1) 獲得了穩(wěn)定、高效表達(dá)hTM的克隆細(xì)胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6;(2) 制備了一株具有較高免疫活性和細(xì)胞、組織特異性的抗人血栓調(diào)節(jié)蛋白McAb NH-1,并成功用于動脈粥樣硬化病人sTM水平的Western blotting檢測。
[Abstract]:Aim: to establish a cloned cell line expressing human thrombomodulin (hTM) stably and to prepare monoclonal antibody (McAb) against human thrombomodulin (hTM). Methods: (1) Recombinant expression plasmid pThr402 was purified and transfected into Cho by lipofectamine liposome. By G418 screening, flow cytometry and Western blotting detection, the cloned cell line CHO-TM was obtained. (2) CHO-TM cells were used as immunogen to immunize Balb / c female mice. The cloned cell lines secreting stable anti-human thrombomodulin MaAb were prepared by conventional fusion method and screened by CELISA, and the subclasses of McAb and its immunological activity were also studied. Cell and tissue specificity and antigen recognition specificity were identified. (3) Blood samples from patients with atherosclerosis were collected and antithrombomodulin McAb was applied to detect the STM level in patients with atherosclerosis by Western blotting. Results: (1) the cloned cell line CHO-TM1 (CHO-TM1) with high expression of hTM was successfully obtained. The percentage of positive cells and the average fluorescence intensity of CHO-TM6 were 89.00% and 9.84% respectively. (2) the anti-human thrombomodulin McAbwas successfully prepared and named as NH-1. The heavy chain of NH-1 was identified as IgGl subclass by double agarose immunodiffusion. CELISA method was used to determine the ascites titer of 5 脳 10 ~ (-5) M750-B ultraviolet spectrophotometer. The ascites antibody content was 20 mg / ml. The antibody was detected to be positive with CHO-TM6 and HUVEC by flow cytometry, and with peripheral red blood cells and white blood cells from Cho and normal subjects. The negative reaction of unactivated platelets. ABC immunohistochemical assay showed that the antibody reacted with small intestine, thymus, spleen, thyroid, gallbladder, ovary, bladder, liver and kidney, except for the cross reaction with uterus and prostate, but also with small intestine, thymus, spleen, thyroid, gallbladder, ovary, bladder, liver and kidney. The stomach and other tissues showed negative reaction. Western blotting analysis showed that McAbs NH-1 could specifically identify protein peptides with a relative molecular weight of about 105 KD in the reduced condition. (3) McAb NH-1 could be used to detect STM levels in atherosclerotic patients by Western blotting. Conclusion: (1) the cloned cell line CHO-TM1 (CHO-TM1) with high expression of hTM was obtained, and (2) a clone cell line CHO-TM1 with high immunological activity and cells was prepared. Tissue specific anti-human thrombomodulin McAb NH-1 was successfully used to detect the level of STM in atherosclerotic patients by Western blotting.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392.1

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本文編號：2120939