【摘要】： 乙型肝炎病毒(Heptitis B virus，HBV)引起的乙型肝炎是嚴重危害人類健康的傳染病。HBV感染可引起急性或慢性肝炎，并且與原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，具有嚴格宿主特異性，不能感染非靈長類實驗動物。目前尚無用于研究HBV感染的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，因此對HBV感染早期階段的分子機制尚缺乏深入了解，特別是與病毒感染過程相關(guān)的細胞蛋白，以及病毒感染對宿主細胞的蛋白表達及功能的影響尚不清楚。 鑒于嗜肝DNA病毒具有相似的病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及復(fù)制特點，因此利用其它動物嗜肝DNA病毒如鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)等建立的細胞感染模型和動物感染模型，可用于研究乙型肝炎病毒復(fù)制和致病機制。在體外培養(yǎng)中，DHBV能夠感染原代鴨肝細胞(Primary Duck Hepatocytes，PDHs)、進行有效的復(fù)制，感染的細胞可釋放具有感染性的病毒顆粒，因此該感染系統(tǒng)對于研究嗜肝DNA病毒復(fù)制早期過程具有很高的價值。許多關(guān)于HBV復(fù)制機理的研究成果便是借助了對DHBV感染模型的研究，如利用DHBV感染模型的研究揭示了HBV復(fù)制過程中逆轉(zhuǎn)錄策略。 以往的研究發(fā)現(xiàn)鴨原代肝細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞對DHBV的易感性逐漸降低，并且逐漸喪失與病毒的結(jié)合能力。培養(yǎng)6天的鴨原代肝細胞培養(yǎng)開始表現(xiàn)出對DHBV的易感性降低，培養(yǎng)8天的PDHs對DHBV的易感性僅為培養(yǎng)二天PDHs的10％。然而，當培養(yǎng)基換為含1.5％二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的無血清培養(yǎng)基時，在培養(yǎng)過程中PDHs對DHBV的易感性降低不明顯。我們通過檢測不同培養(yǎng)時間和不同培養(yǎng)基條件的原代肝細胞內(nèi)的病毒核酸和病毒抗原也證實了上述現(xiàn)象。PDHs對DHBV易感性的改變提示在不同的培養(yǎng)時間以及不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細胞內(nèi)某些蛋白表達發(fā)生了變化，從而影響了宿主細胞的結(jié)構(gòu)與功能并導(dǎo)致其對DHBV的易感性發(fā)生改變。由于病毒進入宿主細胞具有瞬時性和動態(tài)性的特點，因此關(guān)于嗜肝DNA病毒感染早期對細胞蛋白表達和功能的影響的研究存在一定的困難。在本研究中我們利用PDHs-DHBV自然感染細胞模型，借助于蛋白組學(xué)技術(shù)研究與嗜肝DNA病毒早期感染過程相關(guān)的宿主肝細胞蛋白以及病毒感染對宿主肝細胞蛋白表達的影響。 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，目前已被廣泛用于研究各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并取得了很多重大的成就。蛋白質(zhì)組研究具有觀察由多種因素引起的多蛋白質(zhì)組分整體變化的獨特優(yōu)勢，比傳統(tǒng)的研究手段具有更多的信息量。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動了病毒在感染中與宿主細胞蛋白相互作用研究的深入，如在HIV、HBV、HCV等多種病毒研究中均借助于蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新的與病毒相互作用的蛋白，為闡明病毒致病機制奠定了基礎(chǔ)。對HBV蛋白組學(xué)研究主要是集中于HBV X基因?qū)D(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)基因小鼠或病人肝組織蛋白譜的影響研究，以尋找肝癌的早期診斷指標。通過鴨原代肝細胞培養(yǎng)所獲的肝細胞純度高，且可被DHBV自然感染，因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究所獲得的信息將從整體上反應(yīng)肝細胞蛋白的變化。雞全基因組的解密和蛋白組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，為研究DHBV感染對宿主細胞蛋白表達的影響以及尋找與DHBV易感性相關(guān)的細胞蛋白帶來了新的契機。目前有關(guān)鴨基因的相關(guān)研究大多以雞基因組作為參照，鴨與雞在進化上親緣關(guān)系較近，本實驗室曾根椐雞的基因序列擴增并克隆了數(shù)個鴨cDNA基因(鴨γ-干擾素、鴨α-干擾素、β-actin和GADPH)。因此，利用雞全基因組公共數(shù)據(jù)庫可以進行有關(guān)鴨基因或蛋白的分析和預(yù)測，這是我們研究DHBV感染對宿主細胞蛋白表達的影響以及尋找與DHBV易感性相關(guān)的細胞蛋白的重要的基礎(chǔ)。 本論文在建立了PDHs-DHBV感染模型的基礎(chǔ)上，利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)，比較分析了對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細胞總蛋白，基于雞全基因組數(shù)據(jù)庫，借助基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry)成功鑒定了255個差異蛋白點，并運用生物信息學(xué)分析對差異蛋白的功能進行預(yù)測與分類。選取差異蛋白中可能與易感性有關(guān)的蛋白進行相關(guān)基因的克隆及重組表達，并通過細胞內(nèi)共定位和免疫共沉淀等方法研究了目的蛋白與DHBV表面抗原蛋白的相互作用，分析目的蛋白與易感性改變的關(guān)系。 第一章鴨原代肝細胞培養(yǎng)方法的建立與優(yōu)化 根據(jù)文獻報道并結(jié)合本實驗室條件建立了鴨原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法。采用心房灌流法、胸腔動脈灌流法、門靜脈灌流法等三種方法進行鴨肝臟原位灌流與肝細胞分離。通過比較上述三種方法優(yōu)缺點，確定采用經(jīng)優(yōu)化的門靜脈灌流法進行鴨原代肝細胞的分離。與另外兩種方法相比，門靜脈灌流法可使肝臟灌流充分、耗用灌流液少、灌流時間短、不易污染，且分離后的PDHs純度高，分離后的鴨肝細胞于4-6小時可完全貼壁，培養(yǎng)第二天細胞形態(tài)呈肝細胞狀(細胞呈多角形，胞漿內(nèi)可見高折光度脂滴)，并開始增殖生長。 通過DHBV感染實驗，發(fā)現(xiàn)所分離培養(yǎng)的PDHs對DHBV易感性較高，培養(yǎng)2、6、8天的PDHs感染病毒后在細胞內(nèi)均可檢測到病毒核酸。病毒感染細胞上清的斑點雜交結(jié)果顯示PDHs感染DHBV后能釋放病毒，證明鴨原代肝細胞可以支持DHBV的自然感染并完成其復(fù)制周期。比較培養(yǎng)2、6、8天的PDHs感染DHBV 5天后細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的病毒核酸水平，結(jié)果顯示在培養(yǎng)2天的鴨原代肝細胞對DHBV的易感性最高。 第二章對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細胞蛋白組學(xué)研究 利用已建立的PDHs-DHBV感染模型，對不同培養(yǎng)時間及不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的PDHs進行DHBV感染實驗，利用Southern印跡核酸雜交和免疫組化染色法檢測了細胞內(nèi)病毒核酸和抗原。我們將在含5％胎牛血清(fetal bovin serum，F(xiàn)BS)L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第2、4、6、8、10天的PDHs分別感染DHBV，另一組則以含有1.5％DMSO的無血清L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs，在與上述相同的培養(yǎng)后時間點感染病毒。DHBV感染5天后通過檢測細胞內(nèi)病毒抗原的表達以及病毒DNA在細胞內(nèi)的復(fù)制水平，驗證不同培養(yǎng)條件下原代肝細胞對DHBV易感性的差異。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以含5％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加對DHBV的易感性逐漸降低，培養(yǎng)10天的PDHs感染DHBV后在細胞內(nèi)已很難檢測出病毒DNA；當培養(yǎng)基換為含1.5％DMSO的無血清培養(yǎng)基時，培養(yǎng)至第10天的PDHs感染DHBV后細胞內(nèi)病毒核酸才出現(xiàn)較為明顯的減少。不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的PDHs的細胞內(nèi)病毒抗原檢測結(jié)果顯示：以含5％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)8天的PDHs感染DHBV后，DHBpreS/S陽性細胞數(shù)以及細胞內(nèi)的病毒表面抗原量明顯少于培養(yǎng)2天PDHs感染組，PDHs內(nèi)病毒抗原顯色淺且少，提示在含5％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天的PDHs對DHBV的易感性明顯低于5％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)2天的細胞；而用1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs，培養(yǎng)8天與2天的細胞感染DHBV后，細胞內(nèi)DHBpreS/S陽性細胞數(shù)及病毒抗原量相似，提示1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基可維持鴨原代肝細胞對DHBV的易感性。 在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們利用雙向電泳技術(shù)(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)，比較分析了對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細胞總蛋白。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，在5％FBS培養(yǎng)第2天較第8天有132個蛋白表達發(fā)生改變；含1.5％DMSO培養(yǎng)液培養(yǎng)組與含5％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)組比較有123個蛋白改變。在鑒定出的總共255個蛋白中，共有31個為兩組中共同改變的蛋白，其中變化一致的有26個。與FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)第8天相比均上調(diào)的蛋白數(shù)目為20個，下調(diào)的蛋白數(shù)目為6個。結(jié)合PDHs對DHBV易感性的實驗結(jié)果可推測，兩組中表達均上調(diào)的20個差異蛋白可能與PDHs對DHBV易感性增加有關(guān)；兩組中表達均下調(diào)的6個差異蛋白可能與PDHs對DHBV易感性降低有關(guān)。對所鑒定的差異蛋白的生物學(xué)功能進行COG(clusters of orthologous genes)分類，預(yù)測分析結(jié)果顯示，多數(shù)差異蛋白參與新陳代謝，其余蛋白涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)運、細胞增殖等。從26個差異蛋白中選取可能與病毒感染進程相關(guān)的鴨蛋白，以NCBI公布的雞的相關(guān)基因序列為參考設(shè)計引物，以鴨mRNA為模板，通過RT-PCR的方法對鴨蛋白基因Ctm4、annexin A2、vinculin、14-3-3 tau、formiminotransferase cyclodeaminase、put．type 5、HPPD等7個基因進行擴增。通過優(yōu)化PCR條件，成功擴增出鴨Ctm4、annexin A2、14-3-3 tau、HPPD等4種蛋白基因的cDNA。將該4種鴨蛋白基因cDNA序列與Genbank中其他物種相關(guān)基因的進行了同源性分析，結(jié)果顯示，annexin A2、Ctm4、HPPD、14-3-3 tau等cDNA與雞相應(yīng)基因的同源性達85.5％-95.9％，氨基酸序列同源性高達97.2％-99.6％。 第三章對DHBV易感性不同的鴨原代肝細胞的差異蛋白功能研究 在蛋白質(zhì)組研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了分析差異蛋白的相關(guān)功能，從26個差異蛋白中選取可能與病毒感染進程相關(guān)的鴨蛋白，通過構(gòu)建相應(yīng)的重組表達質(zhì)粒研究其體外表達產(chǎn)物與DHBV感染的關(guān)系。鑒于DHBV的表面抗原蛋白DHBpreS/S在病毒感染進程中的重要性，我們研究了上述4種蛋白(annexin A2、Ctm4、HPPD、14-3-3 tau)與DHBpreS/S之間的相互作用。首先將Ctm4、annexin A2、14-3-3 tau、HPPD等4種蛋白cDNA分別克隆至DsRed融合表達載體中(表達鴨相應(yīng)蛋白的DsRed融合蛋白)，，并將DHBpreS/S基因克隆至EGFP融合表達質(zhì)粒(表達DHBpreS/S的EGFP融合蛋白)。將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，觀察相應(yīng)融合蛋白在細胞內(nèi)的表達與定位。之后將4種重組表達質(zhì)粒分別與DHBpreS/S的EGFP融合表達質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細胞，觀察該4種蛋白與DHBpreS/S在細胞內(nèi)的共定位情況。細胞內(nèi)共定位結(jié)果顯示，annexin A2與HPPD可以與DHBpreS/S在細胞內(nèi)共定位，其中annexin A2與DHBpreS/S共定位于胞漿細胞膜附近，而HPPD則共定位于細胞核中。為了進一步驗證annexin A2與HPPD在細胞內(nèi)與DHBpreS/S的相互作用，我們構(gòu)建了表達Myc標簽的annexin A2和HPPD重組表達質(zhì)粒，研究annexin A2和HPPD分別與DHBpreS/S的免疫共沉淀作用。實驗結(jié)果顯示annexin A2與HPPD均可以與DHBpreS/S發(fā)生免疫共沉淀，結(jié)合細胞內(nèi)共定位的結(jié)果，提示該兩種蛋白與DHBpreS/S有相互作用，可能與鴨原代肝細胞對DHBV的感染性有關(guān)。 第四章感染DHBV前后鴨原代肝細胞差異蛋白的蛋白質(zhì)組分析 由于目前尚無用于研究HBV感染的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，對嗜肝DNA病毒感染宿主細胞后所引起的蛋白表達及功能的影響尚不清楚。本章利用鴨原代肝細胞-DHBV自然感染模型，體外模擬DHBV自然感染過程，運用蛋白組學(xué)方法研究分析DHBV感染后PDHs內(nèi)蛋白表達的改變情況。我們將感染與未感染的鴨原代肝細胞提取總蛋白，進行雙向電泳和酶解質(zhì)譜分析。鑒定后的差異蛋白為127個，其中感染后上調(diào)的蛋白有55個，下調(diào)的蛋白有72個。 差異蛋白的功能預(yù)測顯示，參與氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝的蛋白占13％，參與碳水化合物運輸與代謝的占3％，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的相關(guān)蛋白占17％，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的約占13％。亞細胞定位顯示差異蛋白以胞漿蛋白為主，約占46％，其次為核內(nèi)蛋白和線粒體蛋白。DHBV感染后上調(diào)的蛋白有膜連蛋白annexin A5、annexin ⅩⅢ、載脂蛋白(apolipoprotein)、中間絲蛋白、14-3-3蛋白、泛素化相關(guān)蛋白(26S蛋白酶體亞單位GI28872725)等五十余種，多數(shù)蛋白在細胞生命活動中參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道、細胞器轉(zhuǎn)運、胞吞胞吐、細胞分泌等過程。我們通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在DHBV感染的PDHs中APOBEC3G蛋白表達上調(diào)，提示病毒的感染誘使宿主細胞的這一抗病毒因子大量表達，發(fā)揮其抗病毒效果�？共《疽蜃覣POBEC在嗜肝病毒感染中的作用機制可能與HIV感染中相似，而嗜肝病毒是否如同HIV一樣也存在一個對抗這種拮抗作用的蛋白等都需要通過進一步的實驗證明。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373

【引證文獻】

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本文編號：2119843