【摘要】： 乙型肝炎病毒(Heptitis B virus，HBV)引起的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。HBV感染可引起急性或慢性肝炎，并且與原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，具有嚴(yán)格宿主特異性，不能感染非靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前尚無用于研究HBV感染的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，因此對HBV感染早期階段的分子機(jī)制尚缺乏深入了解，特別是與病毒感染過程相關(guān)的細(xì)胞蛋白，以及病毒感染對宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)及功能的影響尚不清楚。 鑒于嗜肝DNA病毒具有相似的病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及復(fù)制特點(diǎn)，因此利用其它動(dòng)物嗜肝DNA病毒如鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)等建立的細(xì)胞感染模型和動(dòng)物感染模型，可用于研究乙型肝炎病毒復(fù)制和致病機(jī)制。在體外培養(yǎng)中，DHBV能夠感染原代鴨肝細(xì)胞(Primary Duck Hepatocytes，PDHs)、進(jìn)行有效的復(fù)制，感染的細(xì)胞可釋放具有感染性的病毒顆粒，因此該感染系統(tǒng)對于研究嗜肝DNA病毒復(fù)制早期過程具有很高的價(jià)值。許多關(guān)于HBV復(fù)制機(jī)理的研究成果便是借助了對DHBV感染模型的研究，如利用DHBV感染模型的研究揭示了HBV復(fù)制過程中逆轉(zhuǎn)錄策略。 以往的研究發(fā)現(xiàn)鴨原代肝細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞對DHBV的易感性逐漸降低，并且逐漸喪失與病毒的結(jié)合能力。培養(yǎng)6天的鴨原代肝細(xì)胞培養(yǎng)開始表現(xiàn)出對DHBV的易感性降低，培養(yǎng)8天的PDHs對DHBV的易感性僅為培養(yǎng)二天PDHs的10％。然而，當(dāng)培養(yǎng)基換為含1.5％二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的無血清培養(yǎng)基時(shí)，在培養(yǎng)過程中PDHs對DHBV的易感性降低不明顯。我們通過檢測不同培養(yǎng)時(shí)間和不同培養(yǎng)基條件的原代肝細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸和病毒抗原也證實(shí)了上述現(xiàn)象。PDHs對DHBV易感性的改變提示在不同的培養(yǎng)時(shí)間以及不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)某些蛋白表達(dá)發(fā)生了變化，從而影響了宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能并導(dǎo)致其對DHBV的易感性發(fā)生改變。由于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞具有瞬時(shí)性和動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，因此關(guān)于嗜肝DNA病毒感染早期對細(xì)胞蛋白表達(dá)和功能的影響的研究存在一定的困難。在本研究中我們利用PDHs-DHBV自然感染細(xì)胞模型，借助于蛋白組學(xué)技術(shù)研究與嗜肝DNA病毒早期感染過程相關(guān)的宿主肝細(xì)胞蛋白以及病毒感染對宿主肝細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響。 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，目前已被廣泛用于研究各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，并取得了很多重大的成就。蛋白質(zhì)組研究具有觀察由多種因素引起的多蛋白質(zhì)組分整體變化的獨(dú)特優(yōu)勢，比傳統(tǒng)的研究手段具有更多的信息量。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了病毒在感染中與宿主細(xì)胞蛋白相互作用研究的深入，如在HIV、HBV、HCV等多種病毒研究中均借助于蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新的與病毒相互作用的蛋白，為闡明病毒致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。對HBV蛋白組學(xué)研究主要是集中于HBV X基因?qū)D(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因小鼠或病人肝組織蛋白譜的影響研究，以尋找肝癌的早期診斷指標(biāo)。通過鴨原代肝細(xì)胞培養(yǎng)所獲的肝細(xì)胞純度高，且可被DHBV自然感染，因此蛋白質(zhì)組學(xué)研究所獲得的信息將從整體上反應(yīng)肝細(xì)胞蛋白的變化。雞全基因組的解密和蛋白組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，為研究DHBV感染對宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響以及尋找與DHBV易感性相關(guān)的細(xì)胞蛋白帶來了新的契機(jī)。目前有關(guān)鴨基因的相關(guān)研究大多以雞基因組作為參照，鴨與雞在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近，本實(shí)驗(yàn)室曾根椐雞的基因序列擴(kuò)增并克隆了數(shù)個(gè)鴨cDNA基因(鴨γ-干擾素、鴨α-干擾素、β-actin和GADPH)。因此，利用雞全基因組公共數(shù)據(jù)庫可以進(jìn)行有關(guān)鴨基因或蛋白的分析和預(yù)測，這是我們研究DHBV感染對宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響以及尋找與DHBV易感性相關(guān)的細(xì)胞蛋白的重要的基礎(chǔ)。 本論文在建立了PDHs-DHBV感染模型的基礎(chǔ)上，利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)，比較分析了對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細(xì)胞總蛋白，基于雞全基因組數(shù)據(jù)庫，借助基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry)成功鑒定了255個(gè)差異蛋白點(diǎn)，并運(yùn)用生物信息學(xué)分析對差異蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測與分類。選取差異蛋白中可能與易感性有關(guān)的蛋白進(jìn)行相關(guān)基因的克隆及重組表達(dá)，并通過細(xì)胞內(nèi)共定位和免疫共沉淀等方法研究了目的蛋白與DHBV表面抗原蛋白的相互作用，分析目的蛋白與易感性改變的關(guān)系。 第一章鴨原代肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立與優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室條件建立了鴨原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。采用心房灌流法、胸腔動(dòng)脈灌流法、門靜脈灌流法等三種方法進(jìn)行鴨肝臟原位灌流與肝細(xì)胞分離。通過比較上述三種方法優(yōu)缺點(diǎn)，確定采用經(jīng)優(yōu)化的門靜脈灌流法進(jìn)行鴨原代肝細(xì)胞的分離。與另外兩種方法相比，門靜脈灌流法可使肝臟灌流充分、耗用灌流液少、灌流時(shí)間短、不易污染，且分離后的PDHs純度高，分離后的鴨肝細(xì)胞于4-6小時(shí)可完全貼壁，培養(yǎng)第二天細(xì)胞形態(tài)呈肝細(xì)胞狀(細(xì)胞呈多角形，胞漿內(nèi)可見高折光度脂滴)，并開始增殖生長。 通過DHBV感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所分離培養(yǎng)的PDHs對DHBV易感性較高，培養(yǎng)2、6、8天的PDHs感染病毒后在細(xì)胞內(nèi)均可檢測到病毒核酸。病毒感染細(xì)胞上清的斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示PDHs感染DHBV后能釋放病毒，證明鴨原代肝細(xì)胞可以支持DHBV的自然感染并完成其復(fù)制周期。比較培養(yǎng)2、6、8天的PDHs感染DHBV 5天后細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清中的病毒核酸水平，結(jié)果顯示在培養(yǎng)2天的鴨原代肝細(xì)胞對DHBV的易感性最高。 第二章對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細(xì)胞蛋白組學(xué)研究 利用已建立的PDHs-DHBV感染模型，對不同培養(yǎng)時(shí)間及不同培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的PDHs進(jìn)行DHBV感染實(shí)驗(yàn)，利用Southern印跡核酸雜交和免疫組化染色法檢測了細(xì)胞內(nèi)病毒核酸和抗原。我們將在含5％胎牛血清(fetal bovin serum，F(xiàn)BS)L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第2、4、6、8、10天的PDHs分別感染DHBV，另一組則以含有1.5％DMSO的無血清L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs，在與上述相同的培養(yǎng)后時(shí)間點(diǎn)感染病毒。DHBV感染5天后通過檢測細(xì)胞內(nèi)病毒抗原的表達(dá)以及病毒DNA在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平，驗(yàn)證不同培養(yǎng)條件下原代肝細(xì)胞對DHBV易感性的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以含5％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加對DHBV的易感性逐漸降低，培養(yǎng)10天的PDHs感染DHBV后在細(xì)胞內(nèi)已很難檢測出病毒DNA；當(dāng)培養(yǎng)基換為含1.5％DMSO的無血清培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)至第10天的PDHs感染DHBV后細(xì)胞內(nèi)病毒核酸才出現(xiàn)較為明顯的減少。不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的PDHs的細(xì)胞內(nèi)病毒抗原檢測結(jié)果顯示：以含5％FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)8天的PDHs感染DHBV后，DHBpreS/S陽性細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞內(nèi)的病毒表面抗原量明顯少于培養(yǎng)2天PDHs感染組，PDHs內(nèi)病毒抗原顯色淺且少，提示在含5％FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天的PDHs對DHBV的易感性明顯低于5％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)2天的細(xì)胞；而用1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的PDHs，培養(yǎng)8天與2天的細(xì)胞感染DHBV后，細(xì)胞內(nèi)DHBpreS/S陽性細(xì)胞數(shù)及病毒抗原量相似，提示1.5％DMSO無血清培養(yǎng)基可維持鴨原代肝細(xì)胞對DHBV的易感性。 在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們利用雙向電泳技術(shù)(2-DE)和質(zhì)譜分析技術(shù)，比較分析了對DHBV易感性有差異的鴨原代肝細(xì)胞總蛋白。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果顯示，在5％FBS培養(yǎng)第2天較第8天有132個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生改變；含1.5％DMSO培養(yǎng)液培養(yǎng)組與含5％FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)組比較有123個(gè)蛋白改變。在鑒定出的總共255個(gè)蛋白中，共有31個(gè)為兩組中共同改變的蛋白，其中變化一致的有26個(gè)。與FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)第8天相比均上調(diào)的蛋白數(shù)目為20個(gè)，下調(diào)的蛋白數(shù)目為6個(gè)。結(jié)合PDHs對DHBV易感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測，兩組中表達(dá)均上調(diào)的20個(gè)差異蛋白可能與PDHs對DHBV易感性增加有關(guān)；兩組中表達(dá)均下調(diào)的6個(gè)差異蛋白可能與PDHs對DHBV易感性降低有關(guān)。對所鑒定的差異蛋白的生物學(xué)功能進(jìn)行COG(clusters of orthologous genes)分類，預(yù)測分析結(jié)果顯示，多數(shù)差異蛋白參與新陳代謝，其余蛋白涉及到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖等。從26個(gè)差異蛋白中選取可能與病毒感染進(jìn)程相關(guān)的鴨蛋白，以NCBI公布的雞的相關(guān)基因序列為參考設(shè)計(jì)引物，以鴨mRNA為模板，通過RT-PCR的方法對鴨蛋白基因Ctm4、annexin A2、vinculin、14-3-3 tau、formiminotransferase cyclodeaminase、put．type 5、HPPD等7個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增。通過優(yōu)化PCR條件，成功擴(kuò)增出鴨Ctm4、annexin A2、14-3-3 tau、HPPD等4種蛋白基因的cDNA。將該4種鴨蛋白基因cDNA序列與Genbank中其他物種相關(guān)基因的進(jìn)行了同源性分析，結(jié)果顯示，annexin A2、Ctm4、HPPD、14-3-3 tau等cDNA與雞相應(yīng)基因的同源性達(dá)85.5％-95.9％，氨基酸序列同源性高達(dá)97.2％-99.6％。 第三章對DHBV易感性不同的鴨原代肝細(xì)胞的差異蛋白功能研究 在蛋白質(zhì)組研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了分析差異蛋白的相關(guān)功能，從26個(gè)差異蛋白中選取可能與病毒感染進(jìn)程相關(guān)的鴨蛋白，通過構(gòu)建相應(yīng)的重組表達(dá)質(zhì)粒研究其體外表達(dá)產(chǎn)物與DHBV感染的關(guān)系。鑒于DHBV的表面抗原蛋白DHBpreS/S在病毒感染進(jìn)程中的重要性，我們研究了上述4種蛋白(annexin A2、Ctm4、HPPD、14-3-3 tau)與DHBpreS/S之間的相互作用。首先將Ctm4、annexin A2、14-3-3 tau、HPPD等4種蛋白cDNA分別克隆至DsRed融合表達(dá)載體中(表達(dá)鴨相應(yīng)蛋白的DsRed融合蛋白)，，并將DHBpreS/S基因克隆至EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒(表達(dá)DHBpreS/S的EGFP融合蛋白)。將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，觀察相應(yīng)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位。之后將4種重組表達(dá)質(zhì)粒分別與DHBpreS/S的EGFP融合表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，觀察該4種蛋白與DHBpreS/S在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。細(xì)胞內(nèi)共定位結(jié)果顯示，annexin A2與HPPD可以與DHBpreS/S在細(xì)胞內(nèi)共定位，其中annexin A2與DHBpreS/S共定位于胞漿細(xì)胞膜附近，而HPPD則共定位于細(xì)胞核中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證annexin A2與HPPD在細(xì)胞內(nèi)與DHBpreS/S的相互作用，我們構(gòu)建了表達(dá)Myc標(biāo)簽的annexin A2和HPPD重組表達(dá)質(zhì)粒，研究annexin A2和HPPD分別與DHBpreS/S的免疫共沉淀作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示annexin A2與HPPD均可以與DHBpreS/S發(fā)生免疫共沉淀，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)共定位的結(jié)果，提示該兩種蛋白與DHBpreS/S有相互作用，可能與鴨原代肝細(xì)胞對DHBV的感染性有關(guān)。 第四章感染DHBV前后鴨原代肝細(xì)胞差異蛋白的蛋白質(zhì)組分析 由于目前尚無用于研究HBV感染的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，對嗜肝DNA病毒感染宿主細(xì)胞后所引起的蛋白表達(dá)及功能的影響尚不清楚。本章利用鴨原代肝細(xì)胞-DHBV自然感染模型，體外模擬DHBV自然感染過程，運(yùn)用蛋白組學(xué)方法研究分析DHBV感染后PDHs內(nèi)蛋白表達(dá)的改變情況。我們將感染與未感染的鴨原代肝細(xì)胞提取總蛋白，進(jìn)行雙向電泳和酶解質(zhì)譜分析。鑒定后的差異蛋白為127個(gè)，其中感染后上調(diào)的蛋白有55個(gè)，下調(diào)的蛋白有72個(gè)。 差異蛋白的功能預(yù)測顯示，參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的蛋白占13％，參與碳水化合物運(yùn)輸與代謝的占3％，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換的相關(guān)蛋白占17％，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的約占13％。亞細(xì)胞定位顯示差異蛋白以胞漿蛋白為主，約占46％，其次為核內(nèi)蛋白和線粒體蛋白。DHBV感染后上調(diào)的蛋白有膜連蛋白annexin A5、annexin ⅩⅢ、載脂蛋白(apolipoprotein)、中間絲蛋白、14-3-3蛋白、泛素化相關(guān)蛋白(26S蛋白酶體亞單位GI28872725)等五十余種，多數(shù)蛋白在細(xì)胞生命活動(dòng)中參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道、細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吞胞吐、細(xì)胞分泌等過程。我們通過蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在DHBV感染的PDHs中APOBEC3G蛋白表達(dá)上調(diào)，提示病毒的感染誘使宿主細(xì)胞的這一抗病毒因子大量表達(dá)，發(fā)揮其抗病毒效果�？共《疽蜃覣POBEC在嗜肝病毒感染中的作用機(jī)制可能與HIV感染中相似，而嗜肝病毒是否如同HIV一樣也存在一個(gè)對抗這種拮抗作用的蛋白等都需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R373

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號：2119843