本文選題：阿爾茨海默氏病 + 血腦屏障　； 參考：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 目的 血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間形成的緊密連接、血管基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突構(gòu)成。它屬于一種代謝和生理性屏障結(jié)構(gòu)，將中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境與外周循環(huán)系統(tǒng)分隔開(kāi)來(lái)。血腦屏障對(duì)于維持正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能非常重要，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)免疫赦免器官，正常情況下免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子不能自由進(jìn)入腦。但是，隨著研究的不斷進(jìn)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，即使在生理狀態(tài)下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在免疫監(jiān)視過(guò)程。在很多疾病，如皰疹病毒性腦炎、HIV腦炎、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病等在病理狀態(tài)下血腦屏障結(jié)構(gòu)均遭到破壞，外周免疫細(xì)胞可以主動(dòng)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)而參與炎癥反應(yīng)，從而啟動(dòng)腦內(nèi)的免疫應(yīng)答，清除可能會(huì)引起腦發(fā)生病變的因子。 而其中阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease，AD)是近年來(lái)一直研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，它是以進(jìn)行性癡呆為主要癥狀的大腦變性疾病，是人類中與年齡相關(guān)發(fā)生認(rèn)知功能逐漸喪失最常見(jiàn)的一種疾病，它嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。因此研究AD的發(fā)病機(jī)制，探索防治AD的干預(yù)靶點(diǎn)，是神經(jīng)科學(xué)的工作重點(diǎn)。 近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥機(jī)制在AD發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。1994年McGeer和Rogers首先提出AD的神經(jīng)慢性退行性變可能是腦內(nèi)免疫和炎癥反應(yīng)不適當(dāng)激活的結(jié)果，超強(qiáng)的免疫反應(yīng)可方向錯(cuò)誤地攻擊神經(jīng)組織而造成細(xì)胞損傷和死亡。最近Togo等人發(fā)現(xiàn)多數(shù)AD患者腦實(shí)質(zhì)內(nèi)T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯多于其他癡呆患者和同齡對(duì)照者。淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，淋巴細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子及其受體的相互作用發(fā)揮了重要作用，但是引起T淋巴細(xì)胞數(shù)量增多的原因，即促使AD患者外周血中的T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的機(jī)制并不清楚。本研究室陳譽(yù)華課題組在研究AD病人T淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障機(jī)制的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)AD病人外周血T淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障體外模型——人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cell，HBMEC)單層的能力顯著增高，而且T淋巴細(xì)胞的穿過(guò)能力顯著高于單核細(xì)胞，B細(xì)胞基本不能穿過(guò)。接著表達(dá)譜芯片分析結(jié)果表明其巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(MacrophageInflammatory Protein，MIP-1α)表達(dá)明顯增高。然而，是否MIP-1α在T淋巴細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層過(guò)程中發(fā)揮作用，還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。 AD的主要神經(jīng)病理特征是細(xì)胞外存在大量由β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protien，Aβ)組成的老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元缺失、以及皮質(zhì)動(dòng)脈和小動(dòng)脈的血管淀粉樣變性。而β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)的沉積是AD發(fā)病的早期過(guò)程和中心環(huán)節(jié)。Aβ的沉積能活化腦內(nèi)具有吞噬活性的小膠質(zhì)細(xì)胞，引起先天性免疫應(yīng)答。 基于此，本文選擇6T-CEM細(xì)胞作為AD病人T淋巴細(xì)胞的模式細(xì)胞，著重探討了MIP-1α-CCR5相互作用在AD病人T淋巴細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障過(guò)程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能，同時(shí)通過(guò)建立Aβ腦內(nèi)沉積動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)注射至大鼠海馬的Aβ_(1-42)能夠誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞MIP-1α依賴性進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，最后通過(guò)體外小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)對(duì)T淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間的“交流”進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步研究T淋巴細(xì)胞在AD病人腦內(nèi)發(fā)揮的作用以及對(duì)AD的治療提供了理論基礎(chǔ)。 方法 一、探討MIP-1α在T淋巴細(xì)胞(6T-CEM)穿過(guò)HBMEC單層過(guò)程中的作用 1、細(xì)胞培養(yǎng) (1)HBMEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清，10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 (2)6T-CEM細(xì)胞培養(yǎng)于10％新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。 2、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1表達(dá) (1)6T-CEM以時(shí)間方式或rhMIP-1α以時(shí)間和濃度方式與HBMEC共同孵育后，，通過(guò)免疫熒光法觀察緊密連接蛋白ZO-1分布。 (2)6T-CEM、MIP-1α中和抗體與HBMEC共同孵育后檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1分布。 3、跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)分析6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層能力及HBMEC單層通透性研究 (1)6T-CEM與不同濃度的rhMIP-1α加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過(guò)進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (2)6T-CEM與不同濃度的MIP-1α中和抗體加入BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過(guò)進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (3)Transwell上室中加入相同濃度rhMIP-1α，分別孵育不同時(shí)間，或者加入不同濃度的rhMIP-1α孵育6h，測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻(Trans Epithelial Electrical Resistance，TEER)，然后通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)進(jìn)行HRP flux分析。 二、探討HBMEC膜受體CCR5在6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層過(guò)程中的作用 1、應(yīng)用Western blot方法分析不同處理因素下HBMEC細(xì)胞膜上CCR5受體及ROCK激酶表達(dá) (1)6T-CEM與HBMEC分別孵育不同時(shí)間后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 (2)rhMIP-1α以濃度和時(shí)間方式與HBMEC作用后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 (3)rhMIP-1α與HBMEC分別孵育不同時(shí)間后，或rhMIP-1α作用于分別經(jīng)過(guò)CCR5中和抗體2D7和ROCK特異性抑制劑Y27632處理的HBMEC后，檢測(cè)HBMEC中cofilin磷酸化情況。 (4)Aβ以濃度與時(shí)間方式與HBMEC作用后，檢測(cè)HBMEC膜受體CCR5表達(dá)。 2、真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法建立高表達(dá)CCR5的HBMEC細(xì)胞株 (1)重組質(zhì)粒pUCmT-CCR5的構(gòu)建 ①以CCR5的基因序列，依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增HBMEC中CCR5基因片斷。 ②T-A克隆將CCR5基因片段連接到pUCmT載體上，命名為pUCmT-CCR5。 ③將重組質(zhì)粒pUCmT-CCR5轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，通過(guò)藍(lán)白篩選，酶切鑒定，驗(yàn)證插入片段的存在。 ④送交測(cè)序，驗(yàn)證插入片段序列的正確性。 (2)真核表達(dá)載體構(gòu)建 ①提取pUCmT-CCR5(含有CCR5基因)和Invitrogen公司載體pcDNA3.1／Myc-HisA質(zhì)粒DNA，將CCR5基因全長(zhǎng)(1kb)定向克隆至pcDNA3.1／Myc-HisA，命名為pcDNA3.1／MH-CCR5。 ②雙酶切驗(yàn)證克隆是否成功，將pcDNA3.1／MH-CCR5送交測(cè)序，驗(yàn)證CCR5基因讀碼框的正確性。 ③利用Qiagen Midi rep質(zhì)粒DNA中量提取試劑盒，分別提取pcDNA3.1／Myc-HisA和pcDNA3.1／MH-CCR5質(zhì)粒DNA。 (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMEC細(xì)胞 ①利用Fugene~(TM) 6 transfection reagent，對(duì)HBMEC進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)10-14天的G418篩選，挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，形成能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞克隆株。 ②利用CCR5的抗體，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)CCR5蛋白的表達(dá)，以此來(lái)鑒定轉(zhuǎn)染成功的單克隆細(xì)胞株。 3、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1表達(dá) 6T-CEM與CCR5中和抗體2D7預(yù)處理的HBMEC共同孵育后檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1分布 4、跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)分析6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層能力 (1)6T-CEM細(xì)胞加入BBB體外模型已形成HBMEC(CCR5+)單層的Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過(guò)進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 (2)6T-CEM細(xì)胞加入到經(jīng)CCR5中和抗體2D7預(yù)處理的BBB體外模型Transwell上室作用20h后，計(jì)數(shù)穿過(guò)進(jìn)入Transwell下室的細(xì)胞數(shù)。 5、雙重免疫熒光技術(shù)觀察HBMEC膜受體CCR5和MIP-1α的定位 三、探討大鼠腦內(nèi)Aβ_(1-42)沉積對(duì)T細(xì)胞遷移入腦的影響 1、Aβ_(1-42)腦內(nèi)沉積動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本采集與處理 (1)制備聚集態(tài)Aβ_(1-42)和Aβ_(42-1)，通過(guò)立體定位儀將Aβ_(1-42)注射到Wistar大鼠雙側(cè)海馬，對(duì)照組注射等體積Aβ_(42-1)和PBS。 (2)標(biāo)本采集與處理 ①心臟采血，肝素抗凝。 ②經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水和4％多聚甲醛，立即取腦。 ③腦組織經(jīng)后固定和蔗糖溶液浸泡，冰凍切片機(jī)上行冠狀切片，片厚10μm。 ④通過(guò)NycoPrep~(TM) 1.077 A and MagCellect Rat CD3+T細(xì)胞分離試劑按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作規(guī)程從肝素化的大鼠全血中分離T淋巴細(xì)胞。 ⑤Trizol提取大鼠T細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。 2、雙重免疫熒光技術(shù)觀察Aβ_(1-42)沉積對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體CCR5表達(dá)及T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的影響 (1)利用vWF和CCR5的抗體，通過(guò)雙重免疫熒光技術(shù)觀察腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受體CCR5表達(dá)。 (2)利用CD3抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察腦內(nèi)T細(xì)胞分布。 (3)大鼠腹腔注射MIP-1α的中和抗體，觀察阻斷MIP-1α的效應(yīng)對(duì)T細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的影響。 3、半定量PCR方法檢測(cè)Aβ_(1-42)腦內(nèi)沉積大鼠T淋巴細(xì)胞MIP-1α表達(dá)情況 四、探討MIP-1α在Aβ反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用 1、細(xì)胞培養(yǎng) (1)BV-2培養(yǎng)于10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液。 (2)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 2、小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) (1)將原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿。 (2)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入不同處理因素(詳見(jiàn)第四部分方法)。 (3)參考CyQuent試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 (4)熒光分光光度計(jì)讀值。 3、NO釋放測(cè)定 (1)將原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿。 (2)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入不同處理因素。 (3)按照NO釋放測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。 (4)酶標(biāo)儀讀值。 4、Aβ吞噬實(shí)驗(yàn) (1)將原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞接種于鋪有蓋片的24孔板中。 (2)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度MIP-1α，同時(shí)加入FITC-Aβ作用不同時(shí)間。 (3)共聚焦顯微鏡觀察并分析熒光含量。 結(jié)果 1、T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1α促使其穿過(guò)HBMEC單層能力增強(qiáng) (1)表達(dá)MIP-1α的T淋巴細(xì)胞(6T-CEM細(xì)胞)或rhMIP-1α與HBMEC相互作用后，引起HBMEC間的緊密連接結(jié)構(gòu)紊亂。 (2)rhMIP-1α能夠促使6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層能力增強(qiáng)，而經(jīng)過(guò)MIP-1α中和抗體處理或針對(duì)MIP-1αsiRNA干擾后的6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層能力降低，同時(shí)緊密連接結(jié)構(gòu)基本保持完整。 2、HBMEC膜受體CCR5介導(dǎo)了T淋巴細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層過(guò)程 (1)6T-CEM或rhMIP-1α與HBMEC相互作用，均引起HBMEC膜受體CCR5表達(dá)升高。 (2)成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1／Myc-HisA-CCR5及穩(wěn)定表達(dá)CCR5基因的HBMEC細(xì)胞克隆株。 (3)6T-CEM穿過(guò)高表達(dá)CCR5的HBMEC單層能力增強(qiáng)，而加入CCR5中和抗體2D7后，6T-CEM穿過(guò)HBMEC單層能力降低，并且緊密連接結(jié)構(gòu)基本保持完整。 (4)rhMIP-1α能夠與HBMEC細(xì)胞膜上的CCR5配體-受體共定位。 (5)MIP-1α-CCR5相互作用通過(guò)ROCK信號(hào)途徑引起緊密連接紊亂。 3、大鼠腦內(nèi)Aβ_(1-42)沉積誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞MIP-1α依賴性遷移入腦 (1)Aβ_(1-42)能夠上調(diào)HBMEC細(xì)胞膜上CCR5受體表達(dá)。 (2)成功制備Aβ_(1-42)在腦內(nèi)沉積的動(dòng)物模型。 (3)并且在腦內(nèi)沉積的模型動(dòng)物中Aβ_(1-42)沉積也能夠誘導(dǎo)外周血T淋巴細(xì)胞MIP-1α和腦內(nèi)皮細(xì)胞上CCR5表達(dá)升高，最終引起外周血T細(xì)胞MIP-1α依賴性穿過(guò)血腦屏障。 4、MIP-1α不能協(xié)同Aβ引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及Aβ吞噬 (1)成功進(jìn)行大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)以及小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2培養(yǎng)。 (2)通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、NO釋放實(shí)驗(yàn)和Aβ吞噬實(shí)驗(yàn)證明，MIP-1α單一因素不能協(xié)同Aβ增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、NO釋放及Aβ吞噬能力。 結(jié)論 1、T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1α與HBMEC細(xì)胞膜上的CCR5受體相互作用，通過(guò)激活HBMEC細(xì)胞中ROCK信號(hào)通路引起緊密連接結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致緊密連接開(kāi)放，使T淋巴細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層能力增強(qiáng)。 2、大鼠腦內(nèi)Aβ_(1-42)沉積能特異性地誘導(dǎo)外周血T細(xì)胞中MIP-1α和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上CCR5受體的高表達(dá)，最終引起外周血T細(xì)胞MIP-1α依賴性入腦。 3、T淋巴細(xì)胞分泌的MIP-1α不能協(xié)同Aβ引起小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及Aβ吞噬，但可能與腦內(nèi)其他因素共同作用參與復(fù)雜的免疫反應(yīng)過(guò)程，從而最終完成Aβ清除。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 曼淑梅,陳譽(yù)華;阿爾茨海默病患者外周血免疫細(xì)胞的亞型變化及其穿過(guò)血腦屏障的能力[J];中國(guó)神經(jīng)精神疾病雜志;2004年04期

本文編號(hào)：2106288